保護素D1通過抑制腎臟炎癥及足突細胞上皮－間充質轉化而抑制早期糖尿病腎病小鼠腎纖維化*

王全勝， 尹紅霞， 張阿麗， 陳建武， 盧芙蓉， 薛卡明， 謝紀文， 劉建國， 李仁康， 鄧安國

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院1中西醫結合科，4腎內科，湖北武漢430022;2荊州市婦幼保健院，湖北荊州434000;3武漢大學中南醫院放化療科，湖北武漢430071)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是導致終末期腎病的重要原因，而足突細胞病變包括足突脫離腎小球基底膜和上皮－間充質轉化(epithelialmesenchymal transition，EMT)在DN進展中起重要作用［1-2］。轉化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)在 DN 腎臟中高表達［3-4］，是 EMT 的關鍵調節因子。另外，炎癥在DN進展中起重要作用［5-7］，是DN治療的關鍵靶點，抑制腎組織中巨噬細胞的浸潤能減輕DN腎臟的炎癥［8-9］。

臨床的研究顯示，n-3不飽和脂肪酸能抗急性或慢性炎癥［10］。保護素D1(protectin D1，PD1)是來源于n-3不飽和脂肪酸的脂蛋白，有抗炎癥作用，能減少腎臟急性缺血/再灌注損傷［11-12］。因此，我們推測PD1可能通過抑制腎臟炎癥和足突細胞EMT而減少早期DN小鼠腎纖維化。為證實該假設，本實驗體內觀察PD1對鏈脲佐菌素誘導的早期DN小鼠的治療作用等，體外觀察PD1對TGF-β1誘導小鼠足突細胞EMT的抑制作用以及其對高糖誘導小鼠巨噬細胞分泌炎癥因子的抑制作用。

材料和方法

1 動物及細胞株

武漢大學動物實驗中心提供的清潔級C57BL/6J雌性小鼠飼養在華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。小鼠巨噬細胞系RAW264．7購自ATCC。永生化小鼠足突細胞系第12代由美國哈佛大學醫學院Peter Mundel教授惠贈。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素(Sigma)，PD1(Cayman)，抗 F4/80抗體(Santa Cruz Biotechnology)，Cy5標記純化的Ⅱ抗 (Jackson Lab)，Hoechst 33342(Sigma)，胎牛血清和RPMI-1640培養基(Gibco)，肌酐酶學分析試劑盒(Thermo Scientific)，TNF-α 和IL-1β ELISA 檢測試劑盒(Biolegend)，TGF-β1(Cell Signaling Technology)，抗成纖維細胞特異性蛋白1(fibroblast-specific protein 1，FSP1)抗體(Millipore)，抗纖連蛋白(fibronectin，FN)抗體(Santa Cruz Biotechnology)，抗zonula occludens-1(ZO-1)抗體(Invitrogen)，抗 P-cadherin抗體(Antibodies-Online)，抗 α-平滑肌肌動蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)抗體(Abcam)和抗 βactin抗體(Sigma)。

3 主要方法

3．1 動物實驗與分組 8周齡小鼠空腹18 h后，連續2 d兩次腹腔注射鏈脲佐菌素(125 mg/kg溶解于pH 4．5檸檬酸緩沖液中)。正常對照組腹腔注射等量生理鹽水。注射藥物5～7 d后，檢測全血血糖(ACCU-CHEK Meter，Roche Diagnostics)，凡隨機血糖超過300 mg/dL視為糖尿病誘導成功，此后每周定期監測血糖。小鼠隨機分為以下3組:正常對照組、DN組和PD1治療(DN+PD1)組，每組6只小鼠。糖尿病造模成功后，PD1治療組小鼠每天腹腔注射PD1(0．08 mg/kg)，共8周，其它組用等量無菌生理鹽水對照。PD1的劑量與用藥方式參見文獻［11-12］。

治療8周后，用代謝籠收集每只小鼠24 h尿量，檢測24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白和尿肌酐。頸椎脫臼處死各組小鼠，稱量小鼠體重和腎重量，同時取血測空腹及隨機血糖和血清肌酐。同時，取左腎一半在4%多聚甲醛固定24 h，后進行石蠟包埋及切片。左腎剩余部分用4%多聚甲醛固定2 h，后在4℃、30%PBS配制的蔗糖中沉降過夜，在OCT包埋劑中包埋－80℃保存以備冰凍切片之用。參照文獻［13］的方法，通過系列篩網分離右腎腎小球，保存在－80℃，為蛋白質檢測準備。

3．2 代謝指標的檢測 糖尿病模型成功后，檢測各組小鼠第1及8周末體重和空腹血糖，在8周末檢測腎重/體重比、24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白和肌酐清除率。參見文獻［14］，用Bradford方法檢測24 h尿蛋白。用ELISA試劑盒(Exocell)檢測24 h尿白蛋白。用肌酐酶學分析試劑盒(Thermo Scientific)檢測尿及血清肌酐。按照文獻的方法［15-16］［24 h尿肌酐 (μg/24 h)÷血清肌酐濃度(g/L)÷1 440(24 h轉化為min)÷體重(g)］計算肌酐清除率。

3．3 腎組織過碘酸 － 雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色分析 對石蠟包埋的腎臟切片(4μm厚)進行PAS染色，參見文獻［17-18］的方法，應用 ImageJ圖像分析系統進行分析。每張切片在400倍光鏡下取50個完整腎小球，計算腎小球系膜基質相對面積(即腎小球系膜基質/腎小球面積比)。

3．4 腎組織間接免疫熒光染色分析 對腎組織冰凍切片做間接免疫熒光染色，參考文獻的方法［19］，冰凍切片(5μm厚)在4%多聚甲醛中固定，后在PBS配制的1%Triton X-100中孵育，再用10%正常羊血清封閉30 min，加入F4/80的Ⅰ抗，隨后加入Cy5標記純化的Ⅱ抗 (1∶100，Jackson Lab)。設非免疫性的IgG為Ⅰ抗的陰性對照，無染色反應(圖片省略)。用Hoechst 33342(1∶1 000，Sigma)對細胞核染色，對腎皮質中F4/80陽性細胞計數，每高倍鏡下每張切片觀察10個視野。

3．5 PD1對高糖作用下RAW264．7細胞分泌腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介 素 1β (interleukin 1β，IL-1β) 的 影 響>RAW264．7細胞培養在含 5．5 mmol/L葡萄糖和10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基(6孔板)中，達到80%融合后，用含0．5% 胎牛血清的RPMI-1640培養基培養24 h，準備開始檢測。為檢測PD1效應，在不同濃度的葡萄糖 (5．5、25和50 mmol/L)刺激下，加入或不加PD1(200 nmol/L)作用18 h。同時，設葡萄糖(5．5 mmol/L)加甘露醇 (44．5 mmol/L)為高滲透壓對照。收集培養上清，用ELISA試劑盒檢測TNF-α和IL-1β。每項檢測，都獨立重復3次以上。

3．6 PD1對小鼠足突細胞EMT的抑制作用 永生化小鼠足突細胞系第12代按Peter Mundel教授報道的方法培養［20-21］。小鼠足突細胞培養在包被1型膠原的培養板中，用含小鼠interferon-γ(5×104U/L)和10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在33℃、5%CO2培養箱中培養。后去掉interferon-γ，在37℃培養10～14 d分化成熟。當80%細胞融合后，用含2%胎牛血清的RPMI-1640在37℃過夜。用TGF-β1(2．0μg/L)刺激細胞，同時添加或不添加 PD1(50 nmol/L或400 nmol/L)。設未添加TGF-β1為正常對照組。處理48 h后，用RIPA蛋白裂解液提取各組細胞胞漿蛋白，為Western blotting檢測目的蛋白準備。

3．7 Western blotting 檢測 參照文獻［22-23］，用Western blotting對細胞或腎小球中目的蛋白進行檢測。分別加入下列Ⅰ抗:抗FSP1、抗FN、抗ZO-1、抗P-cadherin、抗 α-SMA和抗 β-actin抗體。加入 LICOR公司的熒光標記Ⅱ抗檢測，并用Odyssey Imaging System(LI-COR)掃描定量。每項檢測，都獨立重復3次以上。

4 統計學處理

數據用均數±標準誤(mean±SEM)表示。用SPSS12．0軟件One-way ANOVA方法進行統計學分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 PD1減輕糖尿病腎病小鼠代謝指標的紊亂

糖尿病模型成功第1及8周末，各組血糖及血清肌酐水平無顯著差異。與正常對照組小鼠相比較，DN組小鼠24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白、腎重和腎重/體重比顯著增加。與DN組小鼠比較，PD1治療組小鼠中，它們的增加受到抑制。與正常對照組小鼠比較，DN組小鼠8周末的肌酐清除率顯著增加，這符合早期DN的特征［24］。與DN組小鼠相比，PD1治療組小鼠肌酐清除率的增加受到抑制，見表1。這說明PD1治療減輕了DN小鼠的代謝異常。

2 PD1減輕DN小鼠腎小球系膜基質的積聚

與正常對照組小鼠相比較，DN組小鼠腎小球系膜基質顯著積聚。與DN組小鼠比較，PD1治療組中該系膜基質的積聚被顯著抑制(12．50% ±0．53%vs 16．80% ±1．05%，P ＜0．01)，見圖1。

表1 糖尿病1周或8周末各組小鼠代謝指標Table 1．Metabolic data of C57BL/6Jmice at the end of 1 or 8 weeks of diabetes(Mean±SEM．n=6)

Figure 1．PD1 attenuated glomerular mesangial matrix accumulation in DN mice(PAS staining，× 400)．Mean ±SEM．n=6．＊＊P ＜0．01 vs DN．圖1 PD1減輕早期DN小鼠腎小球系膜基質積聚

3 PD1抑制DN小鼠腎小球中間充質細胞標志蛋白α-SMA和FN的表達，恢復其足突細胞丟失的上皮細胞標志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達

與正常對照組小鼠比較，DN組小鼠腎小球中α-SMA和FN的表達顯著增加;與DN組小鼠比較，PD1治療組腎小球中α-SMA和FN的表達被顯著抑制，見圖2。與正常對照組小鼠比較，DN組小鼠腎小球中足突細胞的特異性上皮細胞標志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達顯著減少;與DN組小鼠比較，PD1治療組小鼠腎小球中足突細胞的特異性上皮細胞標志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達顯著增加，見圖2。這些結果顯示，PD1能抑制DN腎小球中間充質細胞標志蛋白FN和α-SMA的表達，恢復DN中足突細胞丟失的上皮細胞標志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達。

4 PD1減輕DN小鼠腎皮質中巨噬細胞的浸潤

與正常對照組小鼠比較，DN組小鼠腎皮質F4/80陽性細胞顯著增加(P＜0．01)。與DN組小鼠比較，PD1組小鼠腎皮質F4/80陽性細胞顯著減少(P ＜0．01)，見圖3。

5 PD1抑制TGF-β1誘導的足突細胞EMT

TGF-β1(2μg/L)刺激足突細胞后，細胞由圓盤形變成拉長的梭形，PD1(400 nmol/L)能抑制其形態的改變，見圖4。Western blotting顯示，與正常組細胞比較，TGF-β1(1μg/L)促進其間充質細胞標志蛋白FSP1和α-SMA的表達，抑制其特異性上皮細胞標志蛋白P-cadherin和ZO-1的表達;PD1(400 nmol/L)抑制TGF-β1誘導的 FSP1和α-SMA表達上調，恢復其誘導的P-cadherin和ZO-1表達減少，見圖5。

6 PD1抑制高糖誘導的小鼠巨噬細胞系RAW264．7細胞過分泌TNF-α和IL-1β蛋白

與正常糖(5．5 mmol/L)比較，RAW264．7 細胞產生TNF-α的能力與高糖的濃度呈劑量依賴性，見圖6A;與正常糖(5．5 mmol/L)比較，RAW264．7 細胞產生IL-1β的能力也與高糖的濃度呈劑量依賴性，見圖6B。甘露醇高滲透壓對照組細胞不影響細胞分泌TNF-α和IL-1β的能力，見圖6A、B。

討 論

大量研究表明，腎臟的炎癥在DN的進程中起重要作用［5-6］。在DN患者腎活檢標本中，巨噬細胞的積聚及細胞間黏附因子的表達顯著增加［7］，而DN腎臟中巨噬細胞與腎間質成纖維母細胞的積聚及纖維化、蛋白尿、腎功能的下降顯著正相關［25-26］，而通過基因敲除巨噬細胞清除受體A及抑制細胞間黏附因子1能抑制DN小鼠腎臟的炎癥反應［8-9］。因此，DN被認為是以巨噬細胞浸潤及炎癥細胞因子產生為特征的腎臟炎癥過程。

PD1是來源于n-3不飽和脂肪酸的脂蛋白，有抗炎癥作用，能減少腎臟急性缺血/再灌注損傷［11-12］。本研究首次發現，PD1能抑制DN小鼠腎臟的巨噬細胞浸潤，能抑制高糖誘導巨噬細胞分泌炎癥性細胞因子IL-1β和TNF-α。同時，PD1抑制DN小鼠腎小球系膜基質的積聚及FN的表達。因此，PD1抗炎癥效應參與了其抑制DN腎小球纖維化，是其抑制DN腎小球纖維化的作用機制之一。

Figure 2．PD1 inhibited glomerularα-SMA and FN expression，and recovered podocyte epithelial markers ZO-1 and P-cadherin expression in DN mice．Mean ± SEM．n=6．＊＊P ＜0．01 vs DN．圖2 PD1抑制DN小鼠腎小球中α-SMA和FN的表達，恢復DN中足突細胞丟失的上皮細胞標志蛋白ZO-1和P-cadherin的表達

Figure 3．PD1 reduced renal cortical macrophage accumulation in DN mice［renal cortical F4/80 positive macrophages(red)and nuclear Hoechst staining(blue)，×200］．Mean ±SEM．n=6．＊＊P ＜0．01 vs DN．圖3 PD1減輕DN小鼠腎皮質中巨噬細胞的浸潤

Figure 4．PD1 inhibited podocyte EMT morphological changes(×200)．N:normal group;PD1:PD1(400 nmol/L)group;TGF-β1:TGF-β1(2 μg/L)group;TGF-β1+PD1:TGF-β1(2 μg/L)+PD1(400 nmol/L)group．Scale bars:40 μm．圖4 PD1抑制TGF-β1誘導的足突細胞EMT形態學改變

TGF-β1在 DN 中高表達［3-4］，是 EMT 的關鍵調節因子，而EMT參與DN腎纖維化進程。在本研究體外實驗中，我們發現PD1能以劑量依賴性方式抑制TGF-β1誘導的足突細胞表達間充質細胞標志蛋白FN、FSP1和α-SMA，能恢復 TGF-β1抑制的足突細胞上皮細胞標志蛋白P-cadherin和ZO-1的表達。足突細胞特異性上皮細胞標志蛋白ZO-1是其裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)區重要組成成分，ZO-1的丟失能導致其去分化以及SD區完整性的損傷［27-28］。P-cadherin是SD區核心蛋白分子，它的減少與早期DN腎臟病變及蛋白尿的進展密切相關［29］。本研究體內實驗表明，PD1能抑制DN腎小球中ZO-1和P-cadherin表達的減少，抑制DN腎小球中間充質細胞標志蛋白α-SMA和FN的增加，與體外的研究結果是一致的。據報道，在早期DN中足突細胞沒有脫落或凋亡，表明足突細胞的脫落不是蛋白尿發生的啟動因素［2］。因此，PD1對DN中足突細胞損傷的保護，是通過抑制DN引起的足突細胞上皮細胞標志蛋白ZO-1和P-cadherin的減少及其間充質細胞標志蛋白FSP1、FN和α-SMA的增加而實現的。PD1可能通過抑制足突細胞EMT，從而減輕DN腎小球纖維化。

總之，PD1能抑制早期DN小鼠的腎小球纖維化，其機制可能與PD1抑制腎臟的炎癥反應和足突細胞EMT有關。這些發現為今后應用PD1及其化學結構類似物防治DN腎小球纖維化提供了實驗依據。

Figure 6．PD1 inhibited the increases in TNF-α (A)and IL-1β (B)production in RAW264．7 cells induced by high glucose．RAW264．7 cells were seeded in 24-well plates under high D-glucose condition with or without PD1(200 nmol/L)for 18 h．Controls are normal D-glucose group(NG，5．5 mmol/L)，normal D-glucose+mannitol group(MA，5．5 mmol/L+44.5 mmol/L)，HG1 group(high D-glucose，25 mmol/L)，and HG2 group(high D-glucose，50 mmol/L)．The culture medium was analyzed by ELISA for RAW264．7-secreted TNF-α and IL-1β proteins．Mean ± SEM．n=3．＊＊P ＜0．01 vs HG2;#P ＜0．05，##P ＜0．01 vs HG1．圖6 PD1抑制高糖誘導的RAW264．7巨噬細胞過分泌TNF-α和IL-1β蛋白