兒茶酚抑素對慢性心力衰竭大鼠室性心律失常的影響

李華波， 陳世健， 胡建華

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院心內(nèi)科，湖北恩施445000)

兒茶酚抑素(catestatin，CST)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型內(nèi)源性血管活性多肽，其前體嗜鉻蛋白顆粒A與兒茶酚胺類激素在腎上腺嗜鉻細(xì)胞及腎上腺能神經(jīng)元胞漿中共同儲存和釋放。既往研究表明CST具有直接及間接抑制兒茶酚胺類激素分泌的作用［1-2］。慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心血管系統(tǒng)常見疾病，隨著人口老年化及壽命的提高，CHF發(fā)病率也隨之升高。兒茶酚胺類激素可作用于心臟β受體而在CHF發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，此外，循證醫(yī)學(xué)證實(shí)β受體阻滯劑是目前唯一能降低心律失常患者總死亡率的抗心律失常藥物［3］。由此提示我們，直接作用于兒茶酚胺類激素分泌階段的CST或許具有抗心律失常作用，為驗證這一猜想，我們開展了本次研究。

材料和方法

1 動物給藥及分組

實(shí)驗用雄性SD大鼠51只，體重200～250 mg，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗動物中心提供。隨機(jī)將動物分為對照(control，CTL)組(n=17)和 CHF組(n=34)。CHF組給予連續(xù)7 d注射異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO;5 mg·kg－1·d－1，ip;Sigma)制備CHF 模型［4］，CTL 組則注射 0．9%生理鹽水(1 mL·kg－1·d－1，ip)。模型制備完成后，將 CHF 組再隨機(jī)分為未治療組(n=17)和CHF治療組(CST組;n=17)。治療組動物給予連續(xù)3周注射CST(2 nmol·kg－1·d－1，ip;Sigma)進(jìn)行治療，未治療組則注射0．9%生理鹽水(1 mL·kg－1·d－1，ip)。完成分組后，在動物給藥及飼養(yǎng)過程中未出現(xiàn)死亡。

2 方法

2．1 心臟超聲檢查 CHF模型制備完成2周后，行超聲心動圖檢查評價造模結(jié)果。大鼠以3%戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg;Sigma)行腹腔注射麻醉，胸部脫毛后固定于仰臥位，連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，使用心臟超聲診斷系統(tǒng)(Vivid 7型，GE)行心臟超聲檢查，S4線控探頭，圖像深度調(diào)制 3．0～5．0 cm，頻率為7.5 MHz。通過M型超聲獲得舒張期室間隔厚度(interventricular septal thickness in diastole，IVSd)及左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in diastole，LVPWd);在心尖四腔心切面測量左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)及左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular endsystolic diameter，IVESD);左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)根據(jù)改良的Simpon公式計算獲得。

2．2 整體心臟離體電生理研究 3組動物各選取14只進(jìn)行離體心臟灌流，每組剩下的3只動物用于膜片鉗研究。以3%戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg)行腹腔注射麻醉，開胸取出心臟連接于Langendorff心臟灌流裝置經(jīng)主動脈逆行灌流，所有動物均給予普通Tyrode’s液灌流，灌流液保持37℃恒溫，灌流速度6～8 mL/min，從取出心臟到實(shí)現(xiàn)灌流在2 min內(nèi)完成。具體操作步驟及灌流液要求參照文獻(xiàn)［5-6］。本實(shí)驗中，1對鉑金刺激電極(兩電極間距為1 mm)連接于LEAD2000B多道電生理儀(四川錦江通用實(shí)業(yè)有限公司)，參照文獻(xiàn)［7］用外殼包被有聚四氟乙烯的銀絲(直徑0．3 mm)自制非極化Ag-AgCl單相動作電位(monophasic action potential，MAP)記錄雙極電極。

2．2．1 記錄MAP 將刺激電極置于左室前游離壁(left anterior free wall，LAF;左前降支左側(cè) 0．5 cm處，左室前壁正中水平)心外膜行基礎(chǔ)周長為300 ms的S1S1刺激(脈寬2 ms、刺激強(qiáng)度為舒張期起搏閾值的2倍)，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm處記錄MAP。待MAP圖形穩(wěn)定后選擇5個連續(xù)的MAP波形，應(yīng)用Chart 7．0軟件測量90%單相動作電位時程(90%of MAP duration，MAPD90)。

2．2．2 測量心室有效不應(yīng)期(ventricular effective refractory period，VERP) 刺激電極置于LAF行程控電刺激，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm測定ERP。在連續(xù)發(fā)放8個起搏刺激波S1后發(fā)放早搏刺激波 S2(S1S1=300 ms，S1S2=300 ms，刺激強(qiáng)度為舒張期起搏閾值的2倍)，S1S2間期自300 ms開始每次減少20 ms直至S1S2=100 ms，隨后以每次減少10 ms的幅度降低S1S2間期，如S2能誘發(fā)出動作電位，則繼續(xù)降低S1S2間期10 ms;如S2不能誘發(fā)出動作電位，則將S1S2增加10 ms，然后以－1 ms反掃直至S2不能誘發(fā)出動作電位。此時的S1S2間期即基礎(chǔ)周長為300 ms時LAF的VERP。

2．2．3 動作電位時程(action potential duration，APD)電交替(alternans，ALT)及室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)的誘發(fā) (1)APD-ALT的誘發(fā):于LAF處行程控S1S1增頻電刺激(刺激強(qiáng)度為舒張期起搏閾值的2倍，脈寬2 ms)，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm。初始起搏周長(pacing cycle length，PCL)為 300 ms，S1S1間期自 300 ms開始每次減少20 ms直至S1S1=140 ms，隨后以每次減少10 ms依次遞減10 ms直至出現(xiàn)電交替。每次刺激持續(xù)30 s，2次刺激間休息30 s。APD-ALT定義為快頻率刺激下標(biāo)測部位連續(xù)2個動作電位的時程呈長短交替［8］。(2)VA 的誘發(fā):行 Burst刺激誘發(fā) VA，將刺激電極置于LAF，給予50 Hz持續(xù)時間2 s的Train刺激，總刺激時間小于2 min。VA持續(xù)時間超過2 s即記為VA可誘發(fā)，超過30 s即記為持續(xù)性VA［9］。

2．3 全細(xì)胞膜片鉗記錄

2．3．1 大鼠心室肌細(xì)胞分離 將各組剩下的3只動物用于細(xì)胞實(shí)驗研究。經(jīng)腹腔注射肝素(3 000 U/kg)使大鼠肝素化，10 min后頸椎脫臼法處死，迅速取出心臟，連接于Langendorff心臟灌流裝置，行主動脈逆行灌流。先用含0．2 g/L乙二胺四乙酸(EDTA)的無鈣Tyrode’s液灌流5 min，隨后用含有膠原酶Ⅰ和蛋白酶E(Sigma)的無鈣Tyrode’s液灌流，所有灌流速度為8 mL/min，待心臟膨大蓬松時停止灌流。取下心臟，剪取LAF置于2 mL含0．1%小牛血清蛋白的無鈣Tyrode’s液中剪碎，稀釋至50 mL后置于37℃恒溫水浴箱中孵化，10 min后用尼龍網(wǎng)過濾收集心室肌細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞懸液在室溫下孵育1 h后備用。具體液體配方及操作步驟參照文獻(xiàn)［10］。

2．3．2 ICa-L記錄及峰電流的測定 全細(xì)胞膜片鉗采用EPC-9放大器和Pulse+Pulsefit 8．8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和分析。將細(xì)胞置于灌流槽內(nèi)經(jīng)無鈣Tyrode’s液持續(xù)恒溫灌流(2 mL/min)。電極阻抗3～5 MΩ并充灌細(xì)胞內(nèi)液 (mmol/L:CsCl 120，CaCl21，MgCl25，HEPES10，EDTA 11，葡萄糖11，Na2ATP 5，pH值用CsOH調(diào)整至7．3)，串聯(lián)電阻控制在4～8 MΩ。室溫控制在22～25℃。高倍鏡下選擇橫紋清晰、邊緣整齊、表面無顆粒、無收縮的細(xì)胞為實(shí)驗對象。在電壓鉗模式下，將保持電壓維持在－40 mV使Na+通道及T型Ca2+通道失活，將命令電壓從－40 mV逐步除極至60 mV，階躍+10 mV，時程150 ms，記錄不同鉗制電壓下的L型鈣通道電流(L-type Ca2+current，ICa-L)強(qiáng)度，最大的 ICa-L即為 ICa-L峰電流。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件分析，正態(tài)分布計量資料兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示;誘發(fā)APD-ALT的 PCL用中位數(shù)描述，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗，結(jié)果以率和構(gòu)成比表示，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CTL組和CHF組超聲結(jié)果比較

與CTL組相比，CHF組 LVEF、LVFS、IVSd和LVPWd均明顯減小(均 P＜0．01)，而 LVEDD和LVESD則明顯增大(均P＜0．01)，表明CHF模型制備成功，見表1。

2 3組大鼠I Ca-L峰電流比較

與CTL組相比，未治療組ICa-L峰電流密度增強(qiáng)(P＜0．01);在給予CST治療后，CST組ICa-L峰電流密度較未治療組明顯縮小(P＜0．01)，且與CTL組相比差異無統(tǒng)計意義(P＞0．05)，說明CST治療可以抑制CHF時過度激活的L型Ca2+電流，見圖1和表2。

表1 CTL組與CHF組超聲指標(biāo)的比較Table 1．Echocardiographic parameters in CTL and CHF groups(Mean±SD)

Figure 1．L-type Ca2+current in CTL，non-treatment and CST groups．圖1 3組動物L(fēng)型Ca2+電流的比較

3 3組大鼠 VERP、MAPD90及 VERP/MAPD90的比較

與CTL組相比，未治療組MAPD90及VERP均增大(均 P ＜0．01)，但 VERP/MAPD90減小(P ＜0．01)。在給予CST治療后，CST組上述指標(biāo)雖未恢復(fù)到CTL組水平，但MAPD90及VERP均較未治療組明顯減小(均P＜0．01)，而 VERP/MAPD90卻較未治療組增大(P＜0．01)，提示CST治療對CHF大鼠電重構(gòu)可以起到一定的改善作用，見圖2和表2。

4 3組大鼠APD-ALT及VA的誘發(fā)結(jié)果

與CTL組相比，未治療組誘發(fā)APD-ALT最大起搏周長(PCLmax)中位數(shù)及VA誘發(fā)率均顯著增大(均P＜0．01);在給予 CST治療后，CST組誘發(fā) APDALT的PCLmax中位數(shù)及VA誘發(fā)率均較未治療組減小(均P＜0．05)，且與對照組相比無明顯差異(均P＞0．05)，說明CST治療可以增加 CHF大鼠 APDALT的誘發(fā)閾值及降低VA的誘發(fā)率，提示CST具有一定的抗心律失常作用，見圖3、4和表2。

Figure 2．Action potential duration in CTL，non-treatment and CST groups．圖2 3組動物動作電位時程的比較

Figure 3．The induced APD-ALT in CTL，non-treatment and CST groups．圖3 各組動物動作電位時程電交替誘發(fā)結(jié)果

Figure 4． The induced VA in CTL，non-treatment and CST groups．圖4 各組大鼠室性心律失常誘發(fā)結(jié)果

表2 各組大鼠相關(guān)電生理指標(biāo)結(jié)果的比較Table 2．Electrophysiological parameters in CTL，non-treatment and CST groups(Mean±SD．n=14)

討 論

CHF患者存在心肌結(jié)構(gòu)重塑的同時還常常伴有電學(xué)重構(gòu)，而心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)又可導(dǎo)致CHF并發(fā)各種心律失常，其中VA尤為常見。流行病學(xué)顯示我國每年約有54萬人死于心源性猝死，而VA是引起心源性猝死的主要原因［11］。既往研究提示現(xiàn)有的針對單一離子通道的抗心律失常藥物并不能降低患者總死亡率，有的甚至增加患者的死亡率［12］，因此尋找新的抗心律失常藥物一直是心血管病研究的熱點(diǎn)問題。近些年來，國內(nèi)外的一些學(xué)者提出將離子通道上游調(diào)控因素(如自主神經(jīng)及其遞質(zhì)和心臟相關(guān)受體等)作為抗心律失常藥物作用的新靶點(diǎn)。嗜鉻顆粒蛋白A是CST前體，其在體內(nèi)可分解為CST和血管抑制素1(vasostatin-1)兩種產(chǎn)物。已有研究證實(shí)血管抑制素能發(fā)揮類似抑制心臟自主神經(jīng)的作用，從而抑制心房顫動的發(fā)生［13］。CST同樣具有顯著抑制兒茶酚胺類激素分泌從而發(fā)揮類似抑制心臟交感神經(jīng)的作用，而CST是否具有抗心律失常的作用既往并無相關(guān)研究。

既往研究表明ISO可導(dǎo)致心肌細(xì)胞溶解性壞死，并最終引起心肌重構(gòu)、室壁變薄及心腔擴(kuò)大等類似慢性心力衰竭的表現(xiàn)［14］。本研究采用腹腔注射ISO的方法制備CHF模型，經(jīng)超聲心動圖結(jié)果證實(shí)CHF模型制備成功。ISO誘導(dǎo)的CHF模型，一方面不存在持續(xù)性損傷因素，更能模擬CHF的病理生理過程，另一方面在制備模型過程中所有動物均未出現(xiàn)死亡，與以往通過手術(shù)方式制備的CHF模型相比，大大降低了動物死亡率。本研究再次證實(shí)該方法制備CHF模型是方便可行安全的。

在本研究結(jié)果中未治療組MAPD90和 VERP均較CTL組明顯延長，但 VERP延長程度小于MAPD90，這導(dǎo)致 VERP/MAPD90比值減小。VERP/MAPD90比值大小是一個反映心肌細(xì)胞電穩(wěn)定性的指標(biāo)，其比值越小，心肌細(xì)胞由于后除極引起VA的機(jī)率越大，即心肌細(xì)胞的電穩(wěn)定性越差［15］。在給予CST治療后CHF大鼠VERP/MAPD90比值較未治療組明顯增加，這可能是CST組VA誘發(fā)率較未治療組減低的一個原因。

在給予S1S1程控增頻刺激的過程中我們發(fā)現(xiàn)，未治療組誘發(fā)APD-ALT的PCLmax中位數(shù)也較CTL組和CST組均明顯增大，即誘發(fā)APD-ALT的頻率閾值下降。APD-ALT指的是快頻率刺激下相鄰2次APD的復(fù)極時間呈現(xiàn)長短交替的現(xiàn)象，其常被視作是惡性心律失常發(fā)生的預(yù)測指標(biāo)［16］。雖然 APDALT的發(fā)生機(jī)制目前尚不十分明確，但有證據(jù)顯示心臟鈣離子流改變在APD-ALT的發(fā)生中起重要作用。Fox等［17］的研究結(jié)果顯示抑制L型Ca2+通道可以抑制APD-ALT的發(fā)生，反之則促進(jìn)APD-ALT。在本研究中，CHF未治療組ICa-L峰電流密度較CTL組明顯增強(qiáng)(P＜0．01)，而在給予CST治療后CST組ICa-L峰電流密度較未治療組明顯減小(P＜0．01)，且與CTL組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。因此，CST治療引起CHF大鼠ICa-L峰電流密度減小進(jìn)而抑制APD-ALT發(fā)生，是CST組VA誘發(fā)率較未治療組減低的另一個原因。