基于網絡藥理學預測生地黃治療銀屑病的分子機制＊

姜春燕，譚 勇，呂 誠，李 立，李 健，張廣中，李元文，姜 淼，韓學杰，呂愛平△

(1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院皮膚科，北京 100010;2.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700;3.北京中醫藥大學基礎醫學院人體形態學系，北京 100029;4.北京中醫藥大學附屬東方醫院皮膚科，北京 100078)

銀屑病俗稱牛皮癬，中醫古稱白疕，是一種常見的慢性復發性炎癥性皮膚病，屬于皮外科的疑難雜癥之一。臨床實踐證明，中醫辨證論治銀屑病能夠取得良好療效，而與西醫診治具有互補性。既往我們對銀屑病的中醫證候分類規律和用藥規律進行了探索，發現血熱證是銀屑病最常見的證型，生地黃是治療其最常用的中草藥［1］。基于我們既往網絡藥理學研究基礎［2，3］，本研究采用網絡藥理學分析方法，預測生地黃治療銀屑病的分子網絡機制，為探索中藥多靶點治療病證的機制研究提供方法學參考。

1 材料與方法

從中華人民共和國藥典(2005版)中查詢生地黃的有效成分，從美國國家衛生研究所(NIH)建立的小分子生物活性數據庫(http://pubchem.Ncbi.him.nih.gov)和基因數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)分別檢索生地黃各個有效成分對應人類活性靶蛋白和銀屑病相關基因(檢索日期:2012年8月29日)，將上述數據導入IPA(Ingenuity Pathway Analysis)數據分析平臺，運行“core analysis”進行數據分析并得到相關結果。

2 結果

2.1 生地黃靶蛋白及靶標網絡

表1顯示，通過檢索PubChem數據庫找到生地黃共有7個靶蛋白。通過IPA軟件構建這些靶蛋白的相互作用網絡(圖1)。該網絡主要展示“與癌癥形成及細胞生長與死亡相關的分子”相互關系特征，提示這些靶蛋白參與癌癥形成及細胞生長與死亡的調控。

表1 生地黃靶標蛋白

2.2 銀屑病相關基因生物學網絡及功能

表2顯示，通過檢索 gene數據庫，共得到165個銀屑病相關基因。把這些基因導入IPA軟件，共能構建15個分子相互作用網絡，這些分子主要涉及3個經典通路，其中涉及銀屑病相關基因最多的是網絡(圖2)中的基因及核轉錄因子 κB(Nuclear Factor Kappa binding，NF-κB)信號通路(圖 4)中的相關基因。圖2主要展示“與皮膚炎癥、結締組織病變相關的分子”相互關系特征，提示這些基因參與皮膚炎癥、結締組織的調控。

圖1 生地黃靶蛋白相互作用網絡

2.3 銀屑病相關基因及生地黃靶蛋白共同參與分子網絡及生物學通路

在IPA系統的Comparison功能中，比較銀屑病相關基因及生地黃靶蛋白共同參與的分子網絡及生物學通路。圖3顯示，腫瘤抑制蛋白(TP53)、核轉錄因子 κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF)、基質金屬蛋白酶-1(MMP1)及基質金屬蛋白酶-2(MMP2)是銀屑病和生地黃共同關聯的分子，提示生地黃可能主要通過調節這些分子對銀屑病發揮治療作用。圖4顯示，NF-κB信號通路是銀屑病相關基因及生地黃靶蛋白共同參與的生物學通路，但它們作用的靶點并不盡相同，提示生地黃靶蛋白GSK3B通過調控NF-κB信號通路對銀屑病發揮治療作用。

表2 銀屑病相關主要基因

圖2 銀屑病相關基因分子網絡

圖3 “生地黃靶蛋白-銀屑病相關基因”分子網絡

3 討論

蛋白質相互作用網絡(Protein-protein Interaction Network)是研究生物功能或病理變化分子基礎的新途徑和新方法，也是目前國際上生物信息學研究的熱點之一［4，5］。發現并建立與疾病相關的分子作用網絡，對于認識復雜疾病至關重要，也是現代生物醫學研究所面臨的重大挑戰［6］。網絡藥理學基本思路是理解疾病“表型-基因-靶點-藥物”相互作用的網絡特征，通過網絡分析觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，尋找可能的組合藥物靶標，預測最優化的組合藥物［2］。基于網絡藥理學關鍵技術研究，對于預測藥效及藥理機制既是方法學創新，又具有重要的社會、經濟效益［7］。許多復雜性疾病，如心血管疾病、腫瘤、糖尿病、銀屑病等是由多基因、多功能蛋白相互作用紊亂而形成的疾病網絡。中藥具有多成分、多靶點及系統調控的網絡功能特征，探索中藥對疾病的調控機制與網絡藥理學的研究思路有許多相似之處［8］。因此，本研究采用網絡藥理學的研究方法探索生地黃治療銀屑病的分子機制。

圖4 銀屑病相關基因及生地黃靶蛋白共同參與的NF-κB信號通路

PubChem數據庫和Gene數據庫是由美國國立衛生研究院(NIH)建立的公共數據庫［9］。通過其中豐富的化合物、生物活性信息和疾病相關基因信息，以及數據庫自身對這些信息進行整合分析的功能，檢索生地黃有效成分靶蛋白和銀屑病相關基因作為我們構建生地黃靶標網絡和銀屑病疾病網絡的分子基礎。IPA生物分析軟件能夠分析、整合、理解來自于基因表達等系統生物學、組學等的實驗數據，能夠搜索到有關基因、蛋白質、化學品和藥物的信息，并能建立起實驗系統的交互模型［10］。在本研究中，我們除了利用IPA平臺構建生地黃靶標網絡和銀屑病疾病網絡，同時利用 IPA軟件中Comparison Analysis的分析功能對這兩個網絡進行比較分析，發現二者網絡的異同點以及二者生物學通路的異同點，進而尋找生地黃治療銀屑病的生物學基礎。

本研究結果顯示，生地黃可能主要通過調節TP53、NF-κB、TNF、MMP1 和 MMP2 五個分子，以及重組人糖原合成酶激酶3β(GSK3B)參與的 NF-κB信號通路對銀屑病發揮治療作用。TP53是調節細胞增殖與凋亡的重要蛋白［11］，能有效地調節表皮細胞的增殖周期，而銀屑病皮損中P53蛋白均表達異常［12，13］，調控機制失去平衡，成為表皮增殖紊亂的重要原因［14］。腫瘤壞死因子(TNF)基因是一種既能直接殺死腫瘤細胞，又能通過激活免疫系統發揮抗腫瘤作用的細胞因子。TNF-a出現在炎癥反應初期，是機體炎癥與免疫反應應答的重要調節因子。TNF-α在銀屑病的發病機制中有著重要作用，是銀屑病炎癥反應的始動因素［15，16］，參與銀屑病的啟動、維持和復發，且與浸潤的細胞成分及角質形成細胞的增殖有關［17］。金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinase，MMPs)是一類結構中含 Zn+和 Ca2+的蛋白水解酶類，是細胞外基質和基底膜降解主要酶類之一。近年來有研究表明，MMPs是銀屑病的新生血管形成的重要因素，在銀屑病的發病中起重要作用［18，19］。NF-κB 是一種作用廣泛的轉錄因子，調控眾多的細胞因子和炎癥介質的基因表達，調節免疫反應，參與細胞內信號傳遞，從而參與調節組織細胞的生理、病理反應［20，21］。免疫介導是銀屑病的主要發生機制，銀屑病患者皮損區一些細胞因子及黏附分子表達異常，其中包括 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α 和神經生長因子(NGF)等［22］，而這些因子編碼基因的啟動子或增強子上都有NF-κB的結合位點。慢性銀屑病斑塊中 NF-κB活化缺陷與皮損的形成有關［23］。NF-κB p65 的異常表達與銀屑病的發生、發展過程密切相關［24，25］。總之，銀屑病疾病位點和生地黃干預靶點都能體現在相同的分子網絡和細胞信號轉導通路上，干預這些分子網絡和通路中的相同或不同的關鍵分子，進而影響整個網絡或通路的生物學功能，這也許就是生地黃治療銀屑病的分子生物學機制之一。生地黃是治療血熱證銀屑病最主要的中草藥［1］，以藥測證，可以推斷上述生地黃的作用靶標，也可能反映了血熱證的生物學特征。

總之，網絡藥理學為探索中藥治療疾證分子機制開辟了一條高通量途徑，為中藥有效成分篩選及探索效應機制，進而為臨床用藥及新藥研發提供了新思路和新方法。目前網絡藥理學仍處于起步發展階段，其研究手段、計算方法及應用軟件還有待進一步探索，基于大量數據庫和算法構建的分子網絡及藥物靶標網絡還需進一步實驗驗證［26］。

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