脾氣虛證代謝綜合征大鼠模型的復(fù)制＊

楊宇峰，滕 飛，石 巖

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032)

成功建立代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)動(dòng)物模型是研究MS的基礎(chǔ)和必須。目前MS的基礎(chǔ)研究多選用大鼠MS模型，按照造模方法一般將MS鼠類模型分為三類，即遺傳型模型、喂養(yǎng)型模型和藥物型模型。喂養(yǎng)型模型主要是使用無(wú)特殊遺傳背景的大鼠為造模對(duì)象，并給予長(zhǎng)期高熱量、高脂肪、高鹽等攝入誘導(dǎo)其表現(xiàn)出MS的相關(guān)臨床癥狀。因其比較穩(wěn)定可靠，且方法簡(jiǎn)單易行、成本低、成模率高，廣泛應(yīng)用于MS實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)以期建立一種經(jīng)濟(jì)、可靠、易于操作、成模周期短、更適合用于研究MS機(jī)制的動(dòng)物模型，同時(shí)考慮到多吃少動(dòng)的現(xiàn)代生活方式所導(dǎo)致的肥胖是MS重要的致病因素［1］，通過(guò)喂飼大鼠高糖高脂飼料成功誘導(dǎo)大鼠MS的模型，為MS的發(fā)病機(jī)制研究提供了可靠的研究平臺(tái)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，體質(zhì)量180±20g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(遼)2004-0018)。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1d，自由飲水，無(wú)不良反應(yīng)及進(jìn)食、飲水和活動(dòng)正常者納入實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

高脂飼料配方:2%膽固醇，丙硫氧嘧啶，20%砂糖，10%玉米油，8%蛋黃粉和60%基礎(chǔ)飼料混合而成。

1.3 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)自然采光，通風(fēng)良好，實(shí)驗(yàn)室全程保持室溫20±3.0℃，濕度40%，明暗周期12h。

1.4 主要試劑

人胰島素(INS，ELISA試劑盒:美國(guó)ADL公司，批號(hào)RT 110371)、膽固醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，編號(hào)69008214，批號(hào) F20061011)。

1.5 主要儀器

電子天平(大連星海電子衡器有限公司MODELDS-671)，全自動(dòng)生化分析儀(日本日立7600型)，TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，全自動(dòng)血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)豪倍優(yōu)型)，數(shù)字體溫計(jì)(歐姆龍MC-612)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

按體質(zhì)量隨機(jī)分成空白對(duì)照組(n=10)和模型組(n=30)2組。

2.2 造模方法

單日喂食甘藍(lán)15～20g/只，自由飲水，游泳至耐力極限。雙日高糖高脂膳食持續(xù)喂養(yǎng)，共計(jì)12周。

2.3 脾氣虛證和代謝綜合征的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

2.3.1 脾氣虛證的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) (1)體毛光亮度減退;(2)倦怠，懶動(dòng);(3)糞便時(shí)軟、時(shí)溏;(4)游泳耐力下降。

2.3.2 代謝綜合證的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) (1)體質(zhì)量增加;(2)空腹血糖增高;(3)血脂異常:空腹血TG增高及(或)HDL-C降低;(4)胰島素抵抗。具備以上4項(xiàng)組成成分中的3項(xiàng)或全部者即可診斷為MS成功模型。

2.4 標(biāo)本采集

標(biāo)本采集前禁食12h，空腹眶后靜脈取血，以3000r/min，4℃離心10min分離血清，分別送檢。

2.5 檢測(cè)項(xiàng)目和方法

2.5.1 一般觀察 體質(zhì)量(每2周測(cè)量1次)、行動(dòng)、糞便、體毛光澤度等。

2.5.2 空腹血糖 采用全自動(dòng)血糖儀測(cè)定。

2.5.3 甘油三脂和高密度脂蛋白 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2.5.4 空腹血清胰島素(FINS)采用酶聯(lián)免疫法。

2.5.5 胰島素敏感指數(shù)(ISI)采用李光偉［2］計(jì)算方法，以空腹血糖與空腹胰島素乘積倒數(shù)的自然對(duì)數(shù)來(lái)表示，即ISI=Ln1/(FPG·FINS)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 19軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)平均數(shù)之間的差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 基線情況

結(jié)果顯示，造模組與正常對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)初始時(shí)在體質(zhì)量、血糖和血脂方面組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，基線水平齊。

表1 體質(zhì)量、空腹血糖及血脂基線情況(±s)

表1 體質(zhì)量、空腹血糖及血脂基線情況(±s)

注:與對(duì)照組比較:△P＞0.05

組 別 樣本量 體質(zhì)量(g)空腹血糖(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)高密度脂蛋白(mmol/L)對(duì)照組 10 168.8±10.23 5.92±1.52 0.89±0.46 1.21±0.15模型組 30 163.5±10.98△ 5.86±1.27△ 0.92±0.38△ 1.14±0.36△

3.2 一般狀況觀察

模型組從第2周后表現(xiàn)為食少懶動(dòng)，體質(zhì)量增加，大便溏薄，異味重，精神萎靡不振，體毛光亮度減退，游泳耐力逐日下降。正常對(duì)照組體質(zhì)量逐日遞增，食欲好，活動(dòng)正常，大便正常，背毛光澤，反應(yīng)靈活。

3.3 體質(zhì)量變化情況

表2 各組大鼠體質(zhì)量血糖的變化(±s)

表2 各組大鼠體質(zhì)量血糖的變化(±s)

注:與對(duì)照組比較:△P＜0.05。

項(xiàng)目 組 別 第2周 第4周 第6周 第8周 第10周 第12周體 質(zhì) 量(g)對(duì)照組 186.3±15.30 210.8±18.80 233.8±23.40 249.3±18.40 272.3±31.20△ 294.6±24.60△模型組 196.2±10.80 228.7±12.60△ 259.3±18.40△ 291.5±23.90 328.6±42.30 341.9±38.30血糖(mmol/L)對(duì)照組 6.14±11.13 5.76± 2.34 6.28± 3.56 6.64± 2.81 6.57± 3.15 6.61± 3.97模型組 6.93± 1.53 7.38± 2.77 8.86± 3.78△ 9.14± 5.38△10.61± 2.54△ 12.97± 6.35△

表2顯示，模型組大鼠體質(zhì)量與正常對(duì)照組比較逐漸增加，從第4周開始2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組大鼠空腹血糖與正常對(duì)照組比較明顯增加，從第6周開始2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.4 血脂變化情況

表3 各組大鼠空腹甘油三酯的變化(±s，mmol/L)

表3 各組大鼠空腹甘油三酯的變化(±s，mmol/L)

項(xiàng)目 組 別 造模后4周 造模后8周 造模后12周0.72±0.25 0.83±0.37 0.78±0.41模型組 1.84±0.22△ 1.88±0.67△ 1.96±0.48△高密度脂蛋白 對(duì)照組 1.08±0.73 1.16±0.20 1.19±0.68模型組 0.82±0.41△ 0.75±0.24△ 0.52±0.38甘 油 三 酯 對(duì)照組△

表3顯示，模型組大鼠甘油三酯與正常對(duì)照組比較明顯增加，2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組大鼠高密度脂蛋白與正常對(duì)照組比較明顯降低，2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.5 胰島素及胰島素敏感指數(shù)變化情況

表4 造模結(jié)束后各組大鼠血清胰島素及胰島素敏感指數(shù)情況

表4顯示，模型組大鼠血清胰島素與正常對(duì)照組比較顯著升高，2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，胰島素敏感指數(shù)顯著下降，2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.6 模型復(fù)制總體情況

根據(jù)模型評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，因模型評(píng)估不達(dá)標(biāo)而剔除4只，并先后有2只大鼠死亡，尸體解剖沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常，推測(cè)可能與游泳后未及時(shí)將大鼠擦干，導(dǎo)致大鼠著涼、體質(zhì)減弱等有關(guān)。其余大鼠均符合成模標(biāo)準(zhǔn)，成模大鼠總共24只，成模率為80%。

4 討論

實(shí)驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，以勞倦加飲食不節(jié)的復(fù)合因素，造成脾氣虛證MS模型。模型組出現(xiàn)了游泳耐力逐日下降，食少懶動(dòng)，大便溏薄，精神萎靡不振，體毛光亮度減退，從第4周后體質(zhì)量開始顯著增加，第6周后空腹血糖增高，甘油三酯和高密度脂蛋白分別從第2周后表現(xiàn)出異常，造模結(jié)束后模型組出現(xiàn)高胰島素血癥、胰島素抵抗，符合本研究擬建立的脾氣虛證、代謝綜合證的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)成功地復(fù)制與人類相似的脾氣虛證MS大鼠模型。

目前，有關(guān)高糖高脂飲食誘導(dǎo) MS模型的機(jī)制還不是很清楚。Pagliassotti MJ等［3］認(rèn)為，高糖可能造成體內(nèi)的氧化損傷，其促氧化效應(yīng)可引起血糖或葡萄糖耐量異常。同時(shí)高碳水化合物飲食可刺激肝臟脂肪的生成，提高血清中甘油三酯的水平，從而引起酯酰輔酶A的升高，升高的酯酰輔酶A增加了脂肪組織中飽和脂肪酸的含量，而脂肪組織中飽和脂肪酸與降低骨骼肌中胰島素的活動(dòng)有關(guān)。可見(jiàn)，脂代謝的紊亂可影響糖代謝中胰島素的分泌，引起糖代謝紊亂。高糖飲食還可引起高胰島素血癥，并導(dǎo)致脂蛋脂酶活性的增高，對(duì)脂肪在體內(nèi)積累具有重要的作用，可引起皮下脂肪和腹腔內(nèi)脂肪積累［4，5］。Wilkes 等［6］認(rèn)為，高脂飲食直接降低胰島素作用下骨骼肌和脂肪組織對(duì)葡萄糖的吸收作用，同時(shí)提高肝臟葡萄糖的生成。因此，攝入高脂飲食會(huì)改變對(duì)胰島素敏感組織葡萄糖的轉(zhuǎn)變規(guī)律，從而導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體糖代謝的紊亂。曹廷兵等［7］認(rèn)為，長(zhǎng)期高脂飲食攝入可通過(guò)影響糖脂代謝和核受體基因參與血脂、胰島素抵抗的發(fā)生，通過(guò)影響炎癥相關(guān)基因、能量調(diào)節(jié)基因參與肥胖和高血壓的發(fā)生。上述基因改變可能是飲食介導(dǎo)MS發(fā)生的原因。游離脂肪酸(FFA)與 MS的發(fā)病有著密切關(guān)系［8］，高糖高脂飲食可能通過(guò)影響 FFA水平導(dǎo)致 MS發(fā)病，F(xiàn)FA濃度的升高通過(guò)特異性地阻斷胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)通路引起胰島素抵抗，還可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和血管反應(yīng)性的異常。

［1］沈成義，閆振成，祝之明.Wistar大鼠代謝綜合征動(dòng)物模型的構(gòu)建及其特征分析［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22(6):526-529.

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