反反相色譜－串聯質譜法直接測定植物源性食品中草甘膦及其代謝物殘留

周 爽，徐敦明，*，林立毅，陳鷺平，周 昱，楊黎忠

(1.廈門出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，福建 廈門 361026;2.集美大學 生物工程學院，福建 廈門 361021)

草甘膦(GLY，結構式見圖1A)是一種常用的、兼具內吸、傳導性、滅生性的除草劑，由于不具有選擇性，可有效防除多種雜草及灌木，已被廣泛用于農田、果園、道路、林業等，是目前世界上應用最廣、生產量最大的廣譜性除草劑。雖然GLY屬于低毒類的有機磷除草劑，但其不合理使用會導致某些農產品受損(如甘蔗［1］等)，影響農產品的國際貿易。此外，植物產品中的GLY殘留超標，會影響消費者食用安全，甚至致病、中毒死亡［2－3］。

不同國家(地區)和相關機構對植物(食品)中GLY的限量標準不同:國際食品法典委員會制定了GLY 28項殘留限量標準，限量范圍在0.05～500 mg之間;美國GLY共172項殘留限量標準，限量范圍在0.05～400 mg之間;歐盟GLY共340項殘留限量標準，其中大豆(干)20 mg、豆類蔬菜0.1 mg等;日本GLY共205項殘留限量標準，限量在0.05～20 mg之間。中國已制定了GLY 11項殘留限量標準，限量在0.05～6.0 mg之間。

由于GLY和氨甲基膦酸(AMPA)(圖1)均為強極性化合物，不溶于大部分有機溶劑，既無紫外吸收，又不易揮發，因此用氣相色譜或高效液相色譜檢測往往需要借助于柱前或柱后衍生化［4－8］，其步驟繁瑣，重復性差;而采用離子色譜法時［9－11］，由于GLY保留很強，分離時必須采用強淋洗劑碳酸鈉，而其它常見陰離子保留較弱無法對GLY和其它陰離子進行同時分析，且僅限于對水等較為單一的基體的測試。近來，用液相色譜－質譜聯用技術檢測草甘膦及其代謝物的方法也有文獻報道，Chen等［12］通過離子色譜與電感耦合等離子體形成八極桿反應池，建立了直接測定土壤中GLY及AMPA的方法，無需衍生化，但操作過程中不僅對緩沖液的pH值要求嚴格，而且需要注入氦氣;Yoshioka等［13］建立了用親水柱HILIC直接測試人體血清中GLY及AMPA的方法，由于血清基質較為單一，經稀釋過濾即可上機分析，前處理方法不適用于食品類復雜基質;Martins－Junior等［14］建立了直接測試黃豆和水中GLY及AMPA的方法，但其檢測低限分別為0.3、0.34 mg/kg，達不到痕量分析的要求;Hao等［15］建立了直接測試水中草甘膦及其代謝物的方法，幾乎不需前處理即可上機分析;江燕等［16］最近也研究了稻米中GLY及AMPA的測試方法，但其前處理較為復雜，分析時間長達25 min。基于上述方法的局限性，建立一種快速、簡捷檢測食品中草甘膦及其代謝物的方法十分必要。本文采用去離子水提取蔬菜、水果和茶葉中的GLY及AMPA，用MAX小柱進行凈化，同時研究了不同凈化條件、流動相以及質譜條件等對測定靈敏度和精密度的影響，前處理方便快捷，不需衍生，在10 min內即可完成對草甘膦及其代謝物的檢測，加標實驗和實際樣品的分析證實該方法切實可行。

圖1 GLY(A)與 AMPA(B)的化學結構式Fig.1 Molecular structures of GLY(A)and AMPA(B)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB sciex 5000高效液相色譜－質譜儀(美國AB公司);IKA T18 Basic均質器(德國IKA公司);草甘膦(CAS No.1071－83－6，美國Sigma－Aldrich公司);氨甲基膦酸(CAS No.1066－51－9，美國Chem Service公司);乙腈(色譜純，美國Tedia公司)，其他試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

分別準確稱取GLY及AMPA各10 mg(精確至0.01 mg)，以水為溶劑配制成100 mg/L標準儲備液，于4℃保存。實驗中根據需要進行稀釋。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取樣品1 g(不含水)或5 g(含水)至50 mL離心管中，加入10 mL水，均質，放置20 min后，于4 000 r/min離心5 min，取上清液，備用。

1.2.2 樣品凈化 用3 mL甲醇活化MAX小柱、氨基柱小柱、HLB小柱后，用2 mL水平衡，再加2 mL 2%氨水，棄去。將上述離心后的樣品加入小柱內，樣品完全附著于小柱內填充物后，加2 mL 2%氨水淋洗，棄去，再依次用2 mL甲醇、2 mL 2%鹽酸甲醇洗脫，收集上述洗脫液，氮吹至干，用1 mL水定容后，過0.2 μm濾膜，將濾液取至取樣瓶中，待用。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱:Diamond Hydride柱(150 mm×2.1 mm，4.0 μm i.d.);流速:0.8 mL/min;進樣量:5 μL;柱溫:35℃;流動相:A為5 mmol/L乙酸銨;B為5%水－95%乙腈的乙酸銨溶液(其中乙酸銨濃度為5 mmol/L);梯度洗脫步驟為:0～3 min內，A保持30%，3.1～7 min，A保持95%，7.1～10 min，A保持30%。

1.2.4 質譜條件 掃描方式:電噴霧負離子(ESI－)掃描;檢測方式:多反應監測(MRM)模式;霧化氣:15 L/min;氣簾氣:12 L/min;輔助加熱氣:氮氣8 L/min;加熱溫度:600℃;噴霧電壓:5 000 V;定量和定性離子、碰撞能量等參數見表1。

表1 GLY和AMPA的質譜檢測參數Table 1 Parameters of MS/MS for GLY and AMPA

1.3 加標回收實驗

準確添加標準溶液于空白樣品中使樣品中GLY濃度為0.02、0.05、0.5 mg/kg，AMPA為0.04、0.1、0.1 mg/kg，室溫渦漩振蕩5 min，備用。按“1.2”分析方法操作，測其回收率，每個濃度設6次重復，計算樣本總體標準偏差和相對標準偏差。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的確立

在電噴霧負離子檢測方式下對GLY和AMPA進行一級質譜分析Q1掃描，得到分子離子(即母離子);對分析化合物的分子離子進行二級質譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子信息，即子離子(圖2);然后優化GLY和AMPA的二級質譜參數，以分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最大時為最佳，得到每種化合物的二級質譜圖;按照二級質譜圖提供的碎片離子信息，選擇兩種化合物的定性離子對(GLY:168.3/63.0;AMPA:110.0/62.9)和定量離子對(GLY:168.3/81.0，168.3/124.0;AMPA:110.0/78.9，110.0/81.0)。

圖2 GLY(A)和AMPA(B)的二級離子碎片掃描圖Fig.2 Mass spectra of GLY(A)and AMPA(B)in product ion scan

2.2 色譜條件的選擇

由于GLY和AMPA的強極性和水溶性，極難在普通反相色譜柱上保留，因此本文比較了兩種親水分離色譜柱HILIC柱和反反相色譜柱的效果。

HILIC親水色譜柱是一種可以保留和分離極性－離子化合物的色譜柱，但只能在有機相較低的條件下解決極性－離子型化合物的保留問題，而反反相色譜柱同時具有反相色譜機理和正相色譜機理，只需改變流動相即可在反相色譜與正相水平間進行轉換，不需要從流動相中完全去除水;使用100%水相洗脫也不會產生柱子崩塌;1 min內可以完成梯度洗脫的再平衡［17－21］。此外，水分子會在HILIC固定相表面形成水膜，而反反相固定相因表面的疏水性較強不會形成水膜。因此，反反相柱不需要用水進行清洗。

鑒于反反相色譜柱的上述優點，本文采用Diamond Hydride反反相色譜柱，對比了不同流動相對色譜的分離和靈敏度。首先考察了不同pH值流動相對色譜分離的影響，結果表明，不同pH值的流動相對GLY及其代謝物的保留幾乎無影響;對比了氨水和乙酸銨水溶液對色譜分離的影響，結果表明，乙酸銨水溶液的色譜峰形更符合色譜分析的要求;對比了不同濃度乙酸銨水溶液對色譜分離的影響，發現隨著乙酸銨濃度的增加，GLY及其代謝物的保留增強，但超過5 mmol/L后呈下降趨勢。因此，本文采用如“1.2.3”所示的流動相，其色譜分離結果如圖3所示。

圖3 50 μg/L GLY(A)和 50 μg/L AMPA(B)的MRM色譜圖Fig.3 Chromatograms of 50 μg/L GLY(A)and 50 μg/L AMPA(B)under MRM mode

2.3 樣品凈化條件的優化

GLY化學名為N-(膦酰基甲基)甘氨酸，屬于弱有機酸，有3個羥基和1個羧基，存在四級電離，分別為:pKa1=0.78，pKa2=2.09，pKa3=5.96，pKa4=10.98;AMPA比GLY少1個羧基，也存在三級電離，因此，GLY和AMPA與溶劑之間既存在離子作用力，又存在氫鍵的范德華力。本文采用陰離子交換柱MAX小柱、親水親酯平衡的HLB小柱和具有強極性的氨基柱，并根據各種小柱的特點和使用條件，對樣品進行凈化，其凈化結果見圖4。結果顯示，陰離子交換柱MAX的分離效果最好，空白加標回收率在90%以上，HLB柱次之，氨基柱最差。因此本文使用MAX小柱凈化樣品。

圖4 不同凈化小柱在不同加標濃度下的凈化結果Fig.4 The purification results of different columns spiked concentration(1 －3):20，50，100 μg/L

2.4 方法的線性范圍及靈敏度

用標準溶液配制成系列濃度的工作液，GLY的質量濃度為10～500 μg/L，AMPA的質量濃度為20～1 000 μg/L，在優化實驗條件下進樣(5 μL)，以進樣質量濃度(X，μg/L)為橫坐標，定量離子對的峰面積(Y)為縱坐標建立標準曲線(見表2)。由表2可見，各分析物的相關系數(r2)均大于0.99，相關性良好。

采用向空白樣品中逐級降低加標濃度的方法來確定檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。以3倍信噪比(S/N=3)對應的目標物濃度作為檢出限，以10倍信噪比(S/N=10)對應的目標物濃度作為定量下限，結果如表2所示。

表2 GLY和AMPA的線性方程、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 2 Calibration curves，limits of detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)for GLY and AMPA

2.5 方法的準確度、精密度及特異性

在優化條件下，對紅茶、綠茶、花茶、青棗、白蘿卜、毛豆6種樣品進行加標回收實驗以及特異性分析。從空白譜圖及加標譜圖看，分析目標物與基體雜質分離很好，不受基體雜質干擾，加標色譜圖和標準溶液色譜圖一致(見圖5)。每個濃度平行做6個重復，加標回收率和精密度結果見表3。6種基質中GLY、AMPA的回收率為78%～113%，相對標準偏差為3.2%～11.0%。實驗結果顯示本方法的基質干擾小，重現性和精密度均可滿足草甘膦及其代謝物的殘留分析要求。

圖5 空白紅茶樣品(A)及其加標樣品(B)的色譜圖Fig.5 Chromatograms of black tea(A)and spiked blank sample(B)spiked concentration of GLY and AMPA were 0.02 mg/kg and 0.04 mg/kg，respectively

表3 不同基體中GLY和AMPA的加標回收率與相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of GLY and AMPA spiked in the 6 matrixes(n=6)

2.6 實際樣品的檢測

利用本文建立的分析方法，對100個茶葉樣品、50個水果樣品和20個蔬菜樣品進行測定，有26個樣品檢出GLY，其中茶葉的檢出率最高，檢出濃度為0.04～3.0 mg/kg，水果和蔬菜的檢出率較低，檢出濃度為0.01～0.5 mg/kg。

3 結論

本文采用水提取，MAX小柱凈化，反反相液相色譜－串聯質譜儀測定，建立了快速檢測茶葉、水果、蔬菜等食品中GLY和AMPA的分析方法。利用建立的方法對170個樣品進行分析，檢出率為21.1%。方法的靈敏度高，回收率良好，適用于食品中GLY和AMPA的測定。

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