流動注射化學發光分析法測定片劑甲氧氯普胺

熊海濤，唐志華，聶 峰，鄭行望

(1.陜西理工學院 化學學院，陜西 漢中 723001;2.陜西師范大學 化學與材料科學學院，陜西 西安 710062)

甲氧氯普胺(Metoclopramide，4-氨基-5氯-N-(二乙胺基乙基)-2-甲氧基-苯甲酰胺，MCPM)，又名胃復安，是中樞性止吐藥和胃腸動力藥，其過量使用會導致人體肌震顫、頭向后傾、斜頸、陣發性雙眼向上注視、發音困難、共濟失調等癥狀及機體的不隨意和重復性運動［1］。因此，建立快速、準確測定甲氧氯普胺含量的分析方法具有重要的現實意義。目前，測定MCPM的方法主要有熒光分析法［2］、分光光度法［3－4］、電化學法［5－7］、高效液相色譜法［8］、電致化學發光分析法等［1，9］。但上述方法存在靈敏度不高，或操作復雜，或儀器試劑昂貴等不足。

化學發光分析法作為一種靈敏度高、分析速度快、成本低、線性范圍寬、儀器設備簡單的分析方法發展迅速，且已應用于藥物分析、免疫分析、礦物分析、環境監測、臨床醫藥、生命科學等方面［10］。而流動注射分析是一種易實現現場與鄰近實驗室聯線的自動分析系統，具有裝置小型化、操作簡單、自動化程度高、分析速度快、分析結果重現性良好、所需試劑量少的特點。因此，流動注射化學發光分析法除了擁有化學發光分析法的優點外，還具有流動注射技術的優點，二者的聯合使用可使其分析特性得到進一步的提高［11］。目前，應用化學發光分析法測定 MCPM的文獻也有報道［12－16］。如吳志皓課題組［12］與范順利［13］等基于甲醛對高錳酸鉀氧化甲氧氯普胺的化學發光反應有很強的增敏作用，建立了流動注射化學發光法測定甲氧氯普胺的新方法，其檢出限分別為0.1、0.2 mg/L，但測定過程中均使用了致癌物質甲醛，其使用受到一定限制。劉偉等［14］利用堿性條件下甲氧氯普胺能夠與魯米諾和亞鐵氰化鉀產生化學發光的現象，結合流動注射技術，對胃復安片劑中的甲氧氯普胺進行了測定，方法的線性范圍較前兩者寬，檢出限為0.04 μg/mL，但分析特性仍不令人滿意。另外，Al－Arfaj［15］與石文兵等［16］分別使用三聯吡啶釕與魯米諾作為發光試劑，并結合流動注射技術建立了化學發光法測定甲氧氯普胺的新方法，其線性范圍更寬，檢出限更低(分別達1.0、0.05 μg/L)。但前者使用的發光試劑三聯吡啶釕比較昂貴，而后者不僅使用比較昂貴的氯金酸，而且利用逆膠束介導法(包括萃取過程)使得測定速度較慢，因而這兩種方法不適合用于臨床檢驗。目前，一種試劑廉價、操作方便、快速且環保的NaIO4－H2O2體系已成功地用于一些自身具有熒光或多酚類物質(包括臨床藥物)的化學發光檢測［17－21］。如聶峰等利用NaIO4－H2O2－H3PO4化學發光體系，并結合流動注射技術，實現了對尿液腎上腺素以及多種有機藥物(如土霉素、林可霉素、鹽酸小檗堿、安替比林、維生素B2、潘生丁、多巴酚丁氨、馬來酸麥角新堿、腎上腺色腙、腎上腺素、異丙腎上腺素、西洋參總皂甙等)的快速分析［18－19］。徐偉民等則基于中性介質中硒對NaIO4－H2O2體系弱化學發光的增敏作用，建立了一種簡易、快速檢測天然水中痕量硒的流動注射化學發光法［20］。但至今未見利用NaIO4－H2O2－H3PO4化學發光體系測定MCPM的文獻報道。

本文研究發現甲氧氯普胺在酸性介質中，可以使NaIO4－H2O2的弱化學發光得到加強，并且溴化鈉的存在可以明顯增大該發光的強度，據此建立了一種簡單、快速測定甲氧氯普胺的化學發光新方法。該方法靈敏度較高、分析速度快、操作簡便。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

IFFM－D流動注射化學發光分析儀(西安瑞邁電子科技公司)，IFFS－A型多功能化學發光檢測器(西安瑞邁電子科技公司)。所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

甲氧氯普胺標準貯備液(1.00×10－2g/L):在0.10 mol/L磷酸介質中，用甲氧氯普胺對照品(中國藥品生物制品檢定所)配制，放置過夜后使用。

高碘酸鈉貯備液(0.05 mol/L):使用前現配，準確稱取NaIO4溶于水中，并定容于棕色容量瓶中;H2O2溶液(30%);溴化鈉溶液(0.05 mol/L)。

1.2 實驗方法

流動注射化學發光儀流路圖如圖1所示。首先，傳送試樣溶液流過并使其完全充滿管路，然后傳送NaIO4、H2O2、H3PO4至管路，此時試樣和體系在 V點混合發生化學發光反應，NaIO4－H2O2混合液流經光電倍增管時體系的發光強度輸出為 I，同時測定試劑空白的發光強度I0，以相對發光強度ΔI(I－I0)對甲氧氯普胺標準溶液的濃度作圖，從而進行定量分析。

圖1 流動注射化學發光分析流程圖Fig.1 Schematic diagram of flow injection CL system

2 結果與討論

2.1 儀器參數的選擇

本文采用濃度為1.00×10－7g/mL的甲氧氯普胺標準液進行考察，同時對流路和光電倍增管的負高壓進行優化。

甲氧氯普胺在NaIO4－H2O2體系中產生化學發光反應，先以2.00 mol/L H3PO4為介質進行流路設計，分別試驗了多種組合，以獲得最強最穩定的化學發光信號和最高的靈敏度，當采用如圖1所示的流路時，得到的相對發光強度最大，且信號穩定，故選擇此流路進行分析。

由于甲氧氯普胺在NaIO4－H2O2體系中能產生快速化學發光反應，因此設計了較短的反應管長(35.0 mm)。考察了光電倍增管的負高壓在－600～－900 V范圍內對體系化學發光信號的影響，結果顯示，負高壓過低時，化學發光強度低，靈敏度不高;而負高壓過高，空白信號與樣品信號均會增強，導致信噪比下降，同時還會使信號不穩定。綜合靈敏度和穩定性，選擇最佳負高壓為－800 V。

圖2 高碘酸鈉濃度對相對化學發光強度的影響Fig.2 Effect of sodium periodate concentration on the relative CL intensity

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 反應介質及其濃度的確定 分別考察了 H2O、HAc、HCl、H2SO4、H3PO4為反應介質時的發光強度，當介質濃度均為1 mol/L時，NaIO4(0.10 mol/L)－H2O2(3%)－甲氧氯普胺(1.00 ×10－7g/mL)－NaBr(0.03 mol/L)體系在上述幾種介質中的相對發光強度分別為11、17、34、60、88，所以實驗選擇H3PO4作為反應介質。分別考察了H3PO4溶液濃度為0.50～3.00 mol/L時的發光強度，結果表明:化學發光強度隨著H3PO4濃度的增大而增大，當H3PO4溶液的濃度達到1.60 mol/L時發光強度最大，之后繼續增大濃度則發光強度減小，所以實驗選擇1.60 mol/L H3PO4作為最佳反應介質。

圖3 H2O2濃度對相對化學發光強度的影響Fig.3 Effect of hydrogen peroxide concentration on the relative CL intensity

2.2.2 NaIO4濃度的選擇 NaIO4是該化學發光體系的重要氧化劑，主要用來氧化甲氧氯普胺。分別考察了NaIO4溶液濃度為0.05～0.30 mol/L時的發光強度(如圖2所示)，發現發光強度隨著NaIO4濃度的增大而增大，當濃度到達0.20 mol/L時達到最大，此后繼續增大NaIO4濃度發光強度反而降低，最終選擇NaIO4的濃度為0.20 mol/L。

2.2.3 H2O2濃度的選擇 考察了H2O2濃度在0.4%～3.0%范圍內的影響(如圖3所示)，結果表明:發光強度隨著H2O2濃度的增大而增大，當濃度達到1.0% 時發光強度達到最大，之后則一直減小，因此實驗選擇H2O2的濃度為1.0%。

2.2.4 溴化鈉溶液濃度的選擇 研究發現，在無溴化鈉存在時，NaIO4－H2O2－甲氧氯普胺反應的發光信號較弱，但加入少量的溴化鈉可極大增強發光信號，表明溴化鈉對該發光反應體系具有較強的增敏作用(如圖4所示)。進一步研究發現:發光強度先隨著 NaBr濃度的增大而增大，當濃度到達0.04 mol/L時發光強度達到最大，因此實驗選擇NaBr的濃度為0.04 mol/L。

圖4 溴化鈉濃度對相對化學發光強度的影響Fig.4 Effect of sodium bromide concentration on the relative CL intensity

2.3 標準工作曲線、檢出限與精密度

在最佳實驗條件下，MCPM濃度在1.00×10－9～1.20×10－6g/mL范圍內與相對發光強度ΔI(扣除空白)呈良好的線性關系，其線性方程為 ΔI=318.37ρ+83.721，其中ΔI是相對化學發光強度，ρ是甲氧氯普胺的質量濃度(mg/L)，相關系數r=0.999 1。對1.00×10－7g/mL的甲氧氯普胺溶液進行11次平行測定，得到相對標準偏差為2.5%。按照IUPAC建議計算出方法的檢出限為3.5×10－10g/mL。

2.4 干擾實驗

在最佳實驗條件下，測定相對誤差在±5%以內時，考察了常見的干擾物對測定1.00×10－7g/mL MCPM時的干擾情況，其允許的倍數為:K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Ba2+(3 000倍);、Zn2+(2 000倍);檸檬酸、酒石酸(1 000倍);Br－、Pb2+、Cu2+、Fe3+(500倍);淀粉、葡萄糖(300倍);苯甲酸(100倍);SCN－(50倍);草酸根(20倍);I－(10倍);SO23－(5倍);抗壞血酸(2倍);聯苯三酚(1倍)。

2.5 實際樣品的分析

2.5.1 片劑中甲氧氯普胺分析 稱取甲氧氯普胺片劑數片，將其研細、混勻。準確稱量后用水溶解、過濾、定容，按照實驗方法進行測定，并與標準方法(藥典法)相對照［21］。結果顯示，本方法與標準方法測定結果較為一致。同時做加標回收試驗，測得回收率為98%～100%，相對標準偏差為2.6%～3.1%(見表 1)。

表1 甲氧氯普胺的回收率與相對標準偏差Table 1 Recoveries and RSDs of metoclopramide

2.5.2 尿液中甲氧氯普胺的分析 由于尿液中通常含有強還原性物質(如尿酸和Vc)，會對甲氧氯普胺測定產生一定的干擾，因此需要對其進行預處理。本文在收集的尿液中先加入一定量的PbO2粉末，攪拌反應15 min左右以消除強還原性物質的干擾。然后對尿液進行過濾以除去雜質和過量的PbO2粉末。再分別準確移取2.00×10－3g/mL甲氧氯普胺標準溶液1.00 mL(1#)、5.00 mL(2#)于兩份過濾后的尿樣中。各準確移取0.50 mL該溶液，置于兩只250 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度并搖勻，對其做加標回收試驗(結果見表2)。從表2可以看出，方法有較好的重現性，回收率為96%～98%，故此法可用于尿樣中甲氧氯普胺的測定。

表2 尿樣中甲氧氯普胺的回收率測定結果Table 2 Results for the determination of metoclopramide recovery in spiked urine

2.6 化學發光機理推測

關于酸性介質中，NaIO4氧化H2O2產生微弱的化學發光，這一發光機理已得到詳盡的探討。發光體(激發體)被認為是該氧化還原反應產生能量較高的氧分子(激發態氧，即單線態氧或1O2*)，1O2

*在水溶液中不穩定，會迅速轉變為普通氧分子，將多余的能量以紅光放出，從而產生發光現象［22－23］。NaIO4氧化甲氧氯普胺時幾乎檢測不出發光強度，而當在NaIO4－H2O2體系中加入少量甲氧氯普胺后化學發光強度明顯增大，所以甲氧氯普胺在高碘酸鈉－過氧化氫－磷酸化學發光體系中是作為能量的接受體，從而增強化學發光，其機制屬于分子間的能量轉移［24］?；谏鲜龈饔^點，推測本文所應用的體系發光機理如下:

3 結論

本文研究了在酸性條件下，溴化鈉對NaIO4－H2O2－甲氧氯普胺的化學發光反應，利用流動注射技術建立了一種測定甲氧氯普胺的新方法。結果表明，該方法準確、靈敏度高，對片劑中甲氧氯普胺含量的檢測與尿液中的加標回收實驗結果表明該方法有望進一步應用于臨床分析。

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