光譜法研究根皮苷與人血清白蛋白相互作用

王迎進，張艷青，李亞雄，李艷芳，張海容

(生化分析技術研究所 忻州師范學院，山西 忻州 034000)

根皮苷(Phlorizin)是一種具有明顯生物活性的天然化合物，其化學成分是1-(2-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-4，6-二羥基苯基)-3-(4-羥基苯基)-丙酮，主要從蘋果、蘋果樹皮及葉中提取而得。現代藥理學研究表明根皮苷具有抗氧化、抗腫瘤及防治糖尿病、美白等生理功效［1－3］。人血清白蛋白(HSA)是人血漿中最豐富的功能蛋白，也是人體內重要的小分子藥物結合蛋白，具有運輸轉運脂肪酸、氨基酸以及多種藥物功能［4］。深入研究HSA與藥物小分子的結合作用，不僅可以從分子水平上闡述藥物小分子的藥效作用機理，而且對藥物的體外篩選、合理開發利用以及設計更加有效的藥物分子具有重要的理論指導意義。因此，HSA與藥物小分子的相互作用研究已成為生命科學、醫學和環境科學等領域的重要研究課題。目前有關根皮苷與HSA的相互作用研究尚未見文獻報道。本實驗采用熒光光譜和紫外光譜法研究了根皮苷與HSA的相互作用機理，得到了根皮苷與HSA相互作用的猝滅常數、結合常數、結合位點數及結合距離，根據熱力學參數確定了其相互作用力類型，采用同步熒光光譜法研究了根皮苷對HSA構象的影響，并考察了5種金屬離子對根皮苷與HSA結合作用的影響，為闡明根皮苷在體內的輸送和代謝過程、了解其生物學作用機理提供了實驗依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301型熒光分光光度計、UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司);501A型超級數顯恒溫水浴(上海浦東榮豐科學儀器有限公司)。

人血清白蛋白(99%，Sigma公司):稱取HSA配制成1.5×10－5mol·L－1標準液，置于冰箱中4℃保存。根皮苷(95%，北京索萊寶科技有限公司):準確稱取根皮苷配制成5.0×10－5mol·L－1標準溶液;Tris－HCl緩沖溶液(pH 7.4);實驗用水為二次蒸餾水，其它試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

準確移取一定體積的根皮苷標準溶液于10 mL比色管中，加入3.5 mL HSA標準溶液，以Tris－HCl緩沖溶液定容至5 mL，恒溫水浴30 min。以285 nm為激發波長，激發和發射狹縫均為5 nm，恒溫掃描一定波長范圍內HSA的熒光光譜、HSA在根皮苷作用下的熒光猝滅光譜、同步熒光光譜(Δλ=15、60 nm)及紫外吸收光譜。

圖1 根皮苷對HSA的熒光猝滅光譜Fig.1 Fluorescence quenching spectra of phlorizin－HSA system 303 K;cHSA=1.05×10－6mol·L－1;cphlorizin(1－10):0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0(×10－6mol·L－1)

2 結果與討論

2.1 根皮苷對HSA的熒光猝滅光譜

蛋白質因含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基而能發射較強的內源熒光。在選定條件下，考察了不同濃度根皮苷溶液對BSA熒光強度的影響，結果如圖1所示。HSA在330 nm處有較強的熒光，隨著根皮苷濃度的增加，HSA在330 nm附近的熒光強度被有規律地猝滅，說明根皮苷與HSA發生了相互作用，導致HSA發生熒光猝滅。

2.2 熒光猝滅機理及猝滅常數的測定

引起HSA熒光猝滅的原因可能有動態猝滅和靜態猝滅兩種。動態猝滅是猝滅劑和熒光分子之間因彼此擴散和碰撞導致熒光物質熒光減弱的現象，其猝滅過程遵循Stern－Volmer方程［5］。

圖2 不同溫度下根皮苷－HSA體系的Stern－Volmer曲線Fig.2 Stern－Volmer curves of phlorizin－HSA system at temperatures of 293，303，313 K

式中:F0和F分別為未加入和加入根皮苷時HSA的熒光強度;Kq為雙分子猝滅過程的猝滅速率常數(L·mol－1·s－1);τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命;Ksv為Stern－Volmer猝滅常數(L·mol－1)。生物大分子的熒光壽命約為 10－8s［6］，故可根據猝滅常數Ksv求得猝滅速率常數Kq。

靜態猝滅是由于猝滅劑與熒光物質相互作用而生成了一定構型化合物，導致熒光物質熒光強度減弱的現象。靜態猝滅過程符合Lineweaver－Bruk雙倒數方程［7］:

式中:KLB為猝滅劑與熒光物質的結合常數，也稱作Lineweaver－Bruk猝滅常數。隨溫度的升高動態猝滅常數增大，而靜態猝滅常數隨之減小，由此可判斷熒光猝滅類型。

按實驗方法分別測定293、303、313 K時體系的熒光猝滅光譜，據式(1)作HSA熒光猝滅的Stern－Volmer曲線(圖2)，據式(2)作雙倒數曲線，得到線性回歸方程及相關系數r，可計算得到猝滅常數Ksv及結合常數KLB(表1)。

表1 根皮苷－HSA體系的猝滅反應常數Table 1 Quenching constants of phlorizin－HSA system

由圖2和表1可知，隨著溫度升高，根皮苷與HSA作用的猝滅曲線斜率降低;根皮苷對HSA熒光猝滅過程的Kq值遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大 Kq值(2 ×1010L·mol－1·s－1);結合常數 KLB隨溫度的升高而減小;均證明根皮苷對HSA的熒光猝滅不是動態猝滅，而是因根皮苷與HSA之間形成了配合物而引起的靜態猝滅［8］。

圖3 根皮苷對HSA的紫外吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of phlorizin－HSA system cHSA=1.05×10－6mol·L－1;cphlorizin(1－10)=0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0(×10－6 mol·L－1)，293 K

2.3 根皮苷與HSA的紫外吸收光譜

紫外吸收光譜是檢測是否生成復合物的一種簡單有效方法，根皮苷與HSA相互作用的紫外吸收光譜如圖3所示，由圖3可知，HSA在278 nm處有一強吸收峰，當加入根皮苷后，吸收強度隨根皮苷濃度的增加逐漸增強，且HSA的最大吸收峰發生明顯紫移(從278 nm減小到266 nm)。進一步證明了根皮苷與HSA形成了基態復合物［9］。

2.4 根皮苷與HSA的結合常數與結合位點數

對于靜態猝滅，熒光強度與猝滅劑的關系可由結合常數表達式［10］推導求出。

將lg［(F0－F)/F］對 lg［Q］作圖，根據截距和斜率可求得相應Kb和n。結果如圖4及表2所示。由表2可知，根皮苷與HSA的結合位點數n接近1，說明根皮苷與HSA可形成1個結合位點。結合常數Kb值較大(在105數量級)，且隨著溫度的升高而降低，表明根皮苷與HSA之間有較強的結合作用，可以被蛋白質運輸和儲存。

2.5 根皮苷與HSA結合反應的熱力學性質及作用力

分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用。當溫度變化不大時，反應的焓變ΔH、熵變ΔS可認為是常數，由熱力學公式可計算根皮苷與HSA相互作用的熱力學函數值。由表3可知，根皮苷與HSA的相互作用過程是一個放熱熵減少過程。根據Ross等［11］總結的生物大分子與小分子作用力類型的熱力學規律，結合過程ΔrHm＜0，ΔrSm＜0，可以推測根皮苷與HSA形成復合物歸因于氫鍵和范德華的形成。這與根皮苷結構中存在多個羥基，易形成氫鍵的事實相符。而ΔrGm＜0，表明根皮苷與HSA的相互作用是自發過程。

圖4 根皮苷對HSA熒光猝滅的Lineweaver－Bruk圖Fig.4 Lineweaver－Bruk curves of HSA quenched by phlorizin

表2 根皮苷－HSA體系的結合常數及結合位點數Table 2 The binding constants and binding sites of phlorizin－HSA system

2.6 根皮苷－HSA體系的同步熒光光譜

Δλ為15、60 nm的同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征［12］。固定HSA濃度逐漸增加根皮苷濃度時，記錄Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜(圖5)。由圖可知，酪氨酸殘基的最大發射波長基本不變，而色氨酸殘基的最大發射波長發生明顯紅移，發射波長由339 nm紅移至343 nm。表明根皮苷的介入引起HSA構象的變化，使色氨酸周圍微環境的親水性增強，HSA結構變得舒展，更易被水分子接近［13］。另外，色氨酸殘基的熒光強度降低比酪氨酸殘基顯著，說明根皮苷與HSA的結合位點更接近于色氨酸殘基。

表3 根皮苷與HSA結合過程的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters of phlorizin－HSA binding procedure

2.7 根皮苷與HSA作用距離計算

根據F rster偶極－偶極非輻射能量轉移理論［14］，可以求出小分子與蛋白質分子中發射熒光基團之間的距離，距離越小，藥物分子越易于被蛋白質儲存與運輸，越能發揮其藥理作用，能量轉移效率E與給體－受體間距離r的關系為:

能量轉移效率(E)為50%時，臨界距離R0(福斯特距離)為:

式中，K為供體和受體各項隨機分布的取向因子，n為介質的折射指數，ΦD為給體的熒光量子產率，J為供體的發射光譜與受體吸收光譜的重疊積分。

只要得到E、K2和n并通過測定光譜求出積分J，就可計算出R0和r。

HSA的熒光光譜和根皮苷的吸收光譜如圖6所示，將光譜重疊部分分割成極小的矩形，通過式(6)求得重疊積分 J(v)=7.54 ×10－15。

上述實驗條件下，取向因子供體受體各項隨機分布的平均值K2=2/3，n折射指數取水和有機物平均值n=1.336，ΦD=0.118，將上述數值代入式(5)求得R0=2.34 nm。再用根皮苷與HSA等摩爾混合后的熒光強度，通過式(6)計算得到能量轉移效率E=0.04。經式(4)求得根皮苷與色氨酸殘基的最短距離r=3.97 nm，說明根皮苷與HSA足夠靠近(r＜7 nm)，其結合是通過非輻射能量轉移促使蛋白質的熒光猝滅。

圖5 根皮苷－HSA體系的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of phlorizin－HSA system

圖6 HSA的熒光光譜與根皮苷的吸收光譜Fig.6 Fluorescence spectra of HSA and the absorption spectra of phlorizin

2.8 金屬離子干擾

生物體內含有多種微量金屬元素，這些元素共同參與各種生命活動。研究微量元素與生物體的作用機理，可以深入了解微量元素在生物體內的生理功能。因此，研究了 Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+5種金屬離子對根皮苷－HSA結合體系的影響，結果見表 4。由表 4可知，Zn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+的介入對根皮苷與 HSA的結合常數影響較小。而Mg2+的介入使根皮苷與HSA的結合常數增加了1個數量級，原因可能是Mg2+在根皮苷與HSA分子之間起到“離子架橋作用”，形成了根皮苷－Mg2+－HSA 復合物［15］。

3 結論

根皮苷對HSA的熒光存在猝滅作用，其熒光猝滅過程是由于形成復合物而引起的靜態猝滅，且發生了分子內的非輻射能量轉移。根據熱力學參數與作用力關系確定二者之間主要以氫鍵及范德華力相互作用;同步熒光光譜表明根皮苷主要與HSA的色氨酸殘基相互作用，并能改變其局部構象;而金屬離子的存在會影響根皮苷與HSA間的結合能力。

表4 金屬離子對根皮苷－HSA體系結合常數的影響(293 K)Table 4 Effects of metal ions on binding constant of phlorizin－HSA system(293 K)

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