金福菇菌種液氮保藏條件的優化研究*

陳志宏 陳炳智 謝寶貴 劉新銳

（福建農林大學生命科學學院菌物研究中心，福州 350002）

金福菇（Tricholoma lobayense Heim）是一種高溫型食用菌，適合夏季出菇。它與草菇、靈芝、毛木耳等高溫型或中高溫型食用菌一樣，菌種在低溫（4 ℃）下保藏，經常出現菌種死亡問題，而在室溫下保藏則易出現菌種老化。菌種保藏的目的是保持良種的優良種性，它是良種保護的重要環節。一般地，菌種處于生長狀態，易出現老化，也易發生變異，菌種保藏技術研究就是為了開發出一種保藏方法，使菌種處于休眠狀態，既不生長也不死亡，以避免變異與老化。目前尚未見到金福菇菌種保藏技術的相關報道，而液氮超低溫保藏菌種已被公認為是保持菌種特性不變和存活力持久最為理想的方法［1，2]，我們通過對金福菇菌種液氮保藏效果的降溫速率、解凍溫度兩個方面進行研究，探索金福菇菌種的液氮保藏技術，以期應用于金福菇種質資源的保藏。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 金福菇“Tr0005”和“Tr0001”兩個菌株均由福建省食用菌種質資源保藏與管理中心提供。

1.2 菌種培養與保藏管制作 聚丙烯飲料管剪成5 cm長，用火焰先把一端溶化封口，滅菌后備用。將已活化2次的PDA平板菌種用小號打孔器截取菌種塊，挑放于無菌聚丙烯飲料管，注入10%甘油，再用火焰封口，靜置過夜。

1.3 降溫程序設計 將制備好的保藏管用CryoGenesis（TM）V5程序降溫儀進行4個不同降溫程序處理試驗（表1），每個程序3個重復，35 ℃解凍。

表1 液氮保藏不同降溫程序處理

1.4 解凍溫度試驗 從液氮罐取出表1所列的C降溫程序處理，保藏3個月后的金福菇菌種，設置4個解凍溫度，即室溫（25 ℃左右）、30 ℃、35 ℃、40 ℃，解凍時間為5 min，每個解凍處理設3個重復。

1.5 保藏效果評價方法 液氮保藏 3個月后的金福菇菌種經解凍，菌種塊用無菌濾紙吸干防凍劑，接種于PDA平板上，每個處理3個重復，28 ℃培養，記錄菌絲萌發時間，統計萌發率，測量菌絲的日生長速度，觀察菌落特征。

2 結果與分析

2.1 不同降溫程序對液氮保藏效果的影響 對試驗菌株按4種不同降溫程序降溫預處理后投入液氮中冷凍保藏3個月，解凍后，活化培養9天，測量數據、拍照。試驗結果（圖1、表2）表明，菌種從25℃降到4 ℃的降溫速度很重要，直接放入液氮中，降溫速度太快，菌種易死亡。適合的降溫速度為7 ℃/min。

圖1 不同程序降溫保藏的菌種生長情況

表2 不同降溫程序降溫液氮保藏的效果比較

2.2 不同解凍溫度對液氮保藏效果的影響 經3個月的液氮冷凍保藏，經不同解凍溫度處理解凍后活化培養10天，測量數據、拍照。結果（表3）表明：液氮保藏后，通過不同解凍處理方法，菌株萌發時間、萌發率、生長速度有差異。35℃解凍的菌株萌發時間較短，生長速度較快，菌絲濃密。30℃解凍的菌株次之，室溫下自然解凍與 40℃條件解凍的菌株萌發率低，生長速度慢。

表3 不同解凍溫度與液氮保藏效果的關系

3 討 論

自1968年Hwang首先應用液氮保藏食用菌菌種以來，液氮保藏因其具有的突出優點而被廣泛應用[1，3]。但有報道不同食用菌品種菌株因未對液氮保藏的降溫程序條件進行優化，導致保藏后仍出現菌種退化和品質下降[4，5]。本試驗還對福建省食用菌種質資源保藏中心的另外2個菌株Tr0007、Tr0013等進行降溫程序、解凍溫度方面的液氮保藏試驗進行優化，其保藏后的檢測結果（具體數據略）與本文試驗菌株的表現規律相一致，只是在同一保藏條件下存在微小的菌株間的差異。

本研究結果表明，金福菇菌種經程序降溫后的保藏效果比直接放進液氮罐中好，萌發時間短，菌絲生長快且濃密。先從室溫以7 ℃/min降至4 ℃，再以1 ℃/min降至—40 ℃效果最好。金福菇菌種在保藏后還需要一定的溫度進行解凍，以 35 ℃解凍后的菌株萌發時間較短，且生長速度較快，菌絲濃密。而影響金福菇菌種液氮保藏效果的因素還較多，如菌種的菌齡和培養基質等，尚需要作進一步的優化研究。

［1]黃河，徐大雅.液氮保存疫霉屬菌種存活期檢測［J].真菌學報，1993，12（1）：48-53.

［2]Gerardo Mata， Rosalía Pérez-Merlo. Spawn viability in edible mushrooms after freezing in liquid nitrogen without a cryoprotectant［J]. Cryobiology， 2003， 47：14-20.

［3]劉新銳，葉夏，王玉青，宋秀高，陳傳明，謝寶貴.香菇菌種液氮保藏技術研究［J].熱帶作物學報，2011，32（7）：1360-1363.

［4]曾輝，王澤生.食用菌菌種保藏研究進展［J].中國食用菌，1994，13（5）：5-6.

［5]陳燕妍.超低溫凍結保藏擔子菌［J].真菌學報，1987，6（2）： 110-117.