跑臺運(yùn)動和一氧化氮合酶抑制劑對去卵巢大鼠骨量及骨組織COL1和TRAP基因表達(dá)的影響

林 敏

（杭州電子科技大學(xué) 體育與藝術(shù)部，浙江 杭州 310018）

0 前 言

隨著人類壽命的增加，世界各地的中老年婦女及男性患骨質(zhì)疏松癥的現(xiàn)象已經(jīng)越來越多［1，2］。2002年，患骨質(zhì)疏松癥或骨量減少的婦女約30萬人，而這一數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)在2020年會增加至41萬［3］。而婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥又是所有類型骨質(zhì)疏松癥中最為常見的一種。醫(yī)學(xué)界針對于婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的多發(fā)現(xiàn)象，已經(jīng)提出若干種干預(yù)措施，而增加體力活動是其中的一項(xiàng)重要的干預(yù)措施［4］。多項(xiàng)研究證明，體力活動對于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預(yù)防具有明顯的作用［5］。而且動物實(shí)驗(yàn)也表明，在大鼠卵巢切除之后，進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)對動物卵巢切除后的骨質(zhì)流失起到了較好的效果［6］。然而，體力活動減緩骨質(zhì)流失的機(jī)制至今尚未完全被闡明，相關(guān)研究有待遇進(jìn)一步深入。

近年來，一氧化氮（NO）在骨代謝中的作用越來越引起研究者的興趣，已有多項(xiàng)離體的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一氧化氮作為骨代謝中的一個重要信號分子，其不僅介導(dǎo)了成骨細(xì)胞的分化和活化［7］，而且也介導(dǎo)了破骨細(xì)胞的凋亡［8］。此外，離體的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也表明，在機(jī)械刺激調(diào)節(jié)骨代謝的過程中，一氧化氮也參與了其中的重要過程。然而，對于一氧化氮對骨代謝的調(diào)節(jié)以及一氧化氮在介導(dǎo)機(jī)械刺激調(diào)節(jié)骨代謝的機(jī)制研究中，限于實(shí)驗(yàn)方法的限制，以往研究多數(shù)集中在離體的細(xì)胞培養(yǎng)層面［9］，而對于一氧化氮在活體內(nèi)調(diào)節(jié)骨代謝的情況研究較少，近來，有若干研究報道了利用一氧化氮合酶（NOS）抑制劑或供體對一氧化氮在骨代謝中作用的研究［10］，這為我們研究運(yùn)動和機(jī)械刺激調(diào)節(jié)骨代謝提供了可以借鑒的實(shí)驗(yàn)方法。

本研究通過對跑臺運(yùn)動和腹腔注射一氧化氮合酶抑制劑N-硝基L-精氨酸甲酯（L-NAME）的方法，以大鼠骨量、成骨細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Ⅰ型膠原蛋白（COL1）的基因相對表達(dá)量以及破骨細(xì)胞標(biāo)志性酶抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的基因相對表達(dá)量為評價指標(biāo)，研究跑臺運(yùn)動對大鼠去卵巢后骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用，和一氧化氮在介導(dǎo)運(yùn)動訓(xùn)練減緩動物去卵巢后骨質(zhì)流失過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 動物分組及去卵巢手術(shù)

32只2月齡Wistar雌性大鼠，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。動物購回適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨即分為4組：假手術(shù)安靜組（S，n＝8）、去卵巢安靜組（O，n＝8）、去卵巢運(yùn)動組（OE，n＝8）和去卵巢運(yùn)動抑制劑組（OEI，n＝8）。其中，O組、OE組和OEI組大鼠均被實(shí)施去卵巢手術(shù)，摘除雙側(cè)卵巢；而S組大鼠則僅僅被實(shí)施去卵巢假手術(shù)，并不摘除卵巢。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，環(huán)境溫度為20±2℃，光照遵循12∶12晝夜周期。

1.2 訓(xùn)練方案

動物在行去卵巢手術(shù)和假手術(shù)后，靜養(yǎng)1周，之后開始對OE組和OEI組大鼠進(jìn)行為期12周的跑臺訓(xùn)練，跑臺速度為15m／min，坡度為零，每周訓(xùn)練5天，第一周每次訓(xùn)練時間為15min，之后每次訓(xùn)練時間固定為30 min。同時，S組和O 組大鼠在每天同一時間放在跑臺上等同的時間，而并不開啟跑臺。

1.3 一氧化氮合酶抑制劑干預(yù)

在運(yùn)動組大鼠每次進(jìn)行跑臺訓(xùn)練前40min，對OEI組大鼠腹腔注射一氧化氮合酶抑制劑L-NAME（購自Sigma），每次注射劑量為每千克體重5mg L–NAME，直至12周的訓(xùn)練周期結(jié)束。

1.4 取材

于運(yùn)動組大鼠最后一次訓(xùn)練結(jié)束禁食12h，斷頸椎處死所有大鼠，分離左側(cè)股骨投入福爾馬林溶液，4℃冰箱保存，待測骨組織Micro CT；分離右側(cè)股骨經(jīng)液氮速凍，-80冰箱保存，待測骨組織TRAP和COL1 基因表達(dá)。

1.5 指標(biāo)的測試

1.5.1 股骨干骺端Micro CT 掃描。將左側(cè)股骨從福爾馬林溶液中取出，用濾紙吸干骨組織表面溶液，用Skyscan 1172型Micro CT 儀對股骨干骺端進(jìn)行掃描，掃描區(qū)域?yàn)楣晒墙松L板以下1cm 范圍內(nèi)的干骺端松質(zhì)骨。發(fā)射X 射線強(qiáng)度設(shè)定為60kV、167μA，測量參數(shù)為骨小梁體積密度（BV／TV），即測量范圍內(nèi)骨小梁體積與松質(zhì)骨骨組織總體積之比，并通過隨機(jī)軟件對測量區(qū)域松質(zhì)骨進(jìn)行三維重構(gòu)，拍攝圖片。

1.5.2 骨組織COL1和TRAP 基因表達(dá)的測定。常規(guī)方法提取右側(cè)股骨骨組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)所要檢測的目的基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢各基因引物序列，由四川華德生物工程有限公司進(jìn)行引物合成，各基因引物序列及擴(kuò)增長度為：COL1：F 5′-GGCAAACATGGAAACCG-3′，R 5′-TCAAGGAAGGGCAAACG -3′，擴(kuò)增長度547 bp；TRAP：F 5′-TGA CAA GAG GTT CCA GGA -3′，R 5′-AGC CAG GAC AGC TGA GTG-3′，擴(kuò)增長度312bp；β-actin：F 5′-CAATTCCATCATGAAGTGTGAC-3′，R 5′-CCACACAGAGTACTTGCGCTC-3′，擴(kuò)增長度184 bp。熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)按照以下體系進(jìn)行，SYBR Premix Ex Taq TM（2×）10μL、PCR Forward Primer（10 μm）0.4μL、PCR Reverse Primer（10μm）0.4μL、ROX Reference Dye（50×）0.4μL、DNA 模板2μL、加DEPC 水使總反應(yīng)體系達(dá)到20μL。Real time PCR 分3階段，擴(kuò)增采用3步法進(jìn)行，溫度循環(huán)參數(shù)如下：Stage 1（1×）：96℃，50s（預(yù)變性）。Stage 2（40×）：96℃，15s；60℃，30s；72℃，45s（收集熒光）。Stage3（1×）：建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線，96 ℃，30 s；60 ℃，90s；94 ℃，15s；每1 ℃收集熒光。反應(yīng)結(jié)束后，PCR 儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)公式2-ΔCt計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各檢測結(jié)果以±S表示，組間差異采用SPSS12.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.01為差異非常顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 股骨干骺端Micro CT 掃描結(jié)果

圖1為各組大鼠股骨近端干骺端松質(zhì)骨三維重構(gòu)圖，從圖中可以看出，S組大鼠骨小梁的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正常，而O組大鼠骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，骨小梁變得較稀疏，骨量降低。由圖2可知，與S組大鼠相比較，O 組大鼠股骨近端干骺端松質(zhì)骨BV／TV 明顯降低（P＜0.01）；而OE組大鼠股骨近端干骺端松質(zhì)骨BV／TV 雖比S 組顯著降低（P＜0.01），但卻比O 組顯著升高（P＜0.01）；OEI組大鼠股骨近端干骺端松質(zhì)骨BV／TV 比S組和OE 組均顯著降低（P＜0.01），而與O 組相比卻無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠股骨近端干骺端松質(zhì)骨骨小梁三維重構(gòu)圖

圖2 各組大鼠股骨近端干骺端松質(zhì)骨骨小梁體積密度（BV／TV）

2.2 股骨COL1和TRAP基因的相對表達(dá)量

由圖3可知，與S 組大鼠相比較，O 組大鼠股骨COL1基因相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；而OE 組大鼠股骨COL1基因相對表達(dá)量雖比S組顯著降低（P＜0.01），但卻比O 組顯著升高（P＜0.01）；OEI組大鼠COL1基因相對表達(dá)量比S組和OE 組均顯著降低（P＜0.01），而與O 組相比卻無顯著性差異（P＞0.05）。

由圖4可知，與S組大鼠相比較，O 組大鼠股骨TRAP基因相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；而OE 組大鼠股骨TRAP基因相對表達(dá)量雖比S組顯著升高（P＜0.01），但卻比O 組顯著降低（P＜0.01）；OEI組大鼠TRAP基因相對表達(dá)量比S組和OE 組均顯著升高（P＜0.01），而與O 組相比卻無顯著性差異（P＞0.05）。

3 分析與討論

3.1 去卵巢手術(shù)及跑臺運(yùn)動對大鼠骨代謝的影響

通過Micro CT 掃描和成像系統(tǒng)，不僅可以形象地顯示動物骨組織松質(zhì)骨骨小梁的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而且可以計(jì)算出反應(yīng)松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的若干參數(shù)。其中骨小梁體積密度（BV／TV）計(jì)算的是測量范圍內(nèi)骨小梁體積與松質(zhì)骨骨組織總體積之比，這一指標(biāo)反應(yīng)了測量范圍內(nèi)松質(zhì)骨骨小梁的疏密程度，代表了測量范圍內(nèi)松質(zhì)骨的骨量［11］。Ⅰ型膠原蛋白（COL1）是成骨細(xì)胞特異性分泌的一種標(biāo)志性蛋白，它代表了成骨細(xì)胞分化的數(shù)量及成骨活性［12］。而抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）是破骨細(xì)胞標(biāo)志性酶，通過TRAP 的測定，可以了解破骨細(xì)胞分化的數(shù)量，以及骨吸收的活性［13］。

圖3 各組大鼠股骨COL1基因相對表達(dá)量

本研究的結(jié)果顯示，與S組大鼠相比較，O 組大鼠股骨近端干骺端松質(zhì)骨BV／TV 明顯降低、股骨COL1基因相對表達(dá)量明顯降低和股骨TRAP基因相對表達(dá)量明顯升高。以往的研究也表明［14］，雌激素在骨基質(zhì)合成中具有重要作用，雌激素缺乏會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。另外研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化也因雌激素的缺乏而大大減少［15］。這說明大鼠去卵巢后，由于雌激素分泌的迅速下降，從而導(dǎo)致大鼠骨代謝的改變，破骨細(xì)胞的作用強(qiáng)于成骨細(xì)胞的作用，正常的骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡被破壞，從而導(dǎo)致骨質(zhì)流失，骨量下降。同時也說明，通過去卵巢手術(shù)模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的動物造模方法是可取的。

圖4 各組大鼠股骨TRAP基因相對表達(dá)量

Figard的研究表明［16］，游泳訓(xùn)練可以有效減緩大鼠去卵巢后骨密度的下降，Iwamoto等人的研究也表明［17］，跑臺運(yùn)動可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠的骨形成作用。運(yùn)動訓(xùn)練對于減緩動物去卵巢后骨質(zhì)流失的事實(shí)在本研究中也進(jìn)一步得到證實(shí)，在本研究中，OE 組大鼠股骨近端干骺端松質(zhì)骨BV／TV 比O 組顯著升高、股骨COL1基因相對表達(dá)量明顯升高和股骨TRAP基因相對表達(dá)量明顯降低。這說明跑臺運(yùn)動可以減緩大鼠去卵巢后破骨細(xì)胞的生成和活化，并促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的成骨作用，從而達(dá)到減緩大鼠去卵巢后骨質(zhì)流失的作用。

3.2 一氧化氮在介導(dǎo)運(yùn)動訓(xùn)練調(diào)節(jié)去卵巢大鼠骨代謝過程中的作用

研究表明，一氧化氮對成骨細(xì)胞具有多種效應(yīng)。一些研究表明［18］，NO 介導(dǎo)了雌激素對骨的合成代謝作用，大鼠被注射了一氧化氮合酶抑制劑后，其雌激素阻止骨丟失的作用則被阻斷。NO 在雌激素介導(dǎo)的骨形成作用中也具有重要作用，活體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了NO 在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能方面的作用［19］。另外，NO 也可能是機(jī)械信號在骨骼中傳導(dǎo)過程中的一個重要信號分子［20］。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞受到切應(yīng)力刺激后會很快釋放出一氧化氮，這是由于機(jī)械刺激激活了內(nèi)皮型一氧化氮合酶［21］，內(nèi)皮型一氧化氮合酶是成人骨中一氧化氮合酶的最主要的亞型，并且在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中，內(nèi)皮型一氧化氮合酶的基因表達(dá)以及其產(chǎn)物一氧化氮的增加可被機(jī)械應(yīng)力上調(diào)［22］。一氧化氮下游信號的傳導(dǎo)可以依賴于苷酸環(huán)化酶的激活或是一氧化氮直接與亞硝基化蛋白作用，正如在Fan等人的研究中，一氧化氮可減少基質(zhì)細(xì)胞中RANKL／OPG 的比率［23］。也有研究證明［24］，在嚙齒類動物中，骨對體內(nèi)載荷的反應(yīng)也需要一氧化氮的參與。

L–NAME是L-精氨酸的類似物，作為一氧化氮合酶的抑制劑，它對一氧化氮合酶的三個亞型的生成均有抑制作用［25］。大鼠體內(nèi)注射一氧化氮合酶抑制劑L– NAME后，其骨組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶的蛋白表達(dá)量顯著降低，同時骨組織局部NO 含量降低［26］。另外，大鼠在切除卵巢后即刻注射L–NAME 可加速骨質(zhì)流失的速度，而對于沒有切除卵巢或雌激素分泌正常的大鼠來講，使用或不使用一氧化氮合酶抑制劑L– NAME 并不影響大鼠的骨量的變化［27］。目前，通過注射L–NAME的方法進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練對于動物去卵巢后骨代謝影響的研究還未見報道，僅有的一篇關(guān)于注射L– NAME 和力學(xué)負(fù)荷對骨代謝影響的研究表明，注射了一氧化氮合酶抑制劑的大鼠在過量力學(xué)負(fù)荷的刺激下，其脛骨松質(zhì)骨的骨量丟失可達(dá)66%［28］。

在本研究中，與未注射L– NAME 的去卵巢運(yùn)動組（OE組）相比，進(jìn)行跑臺訓(xùn)練并在訓(xùn)練前注射L–NAME的OEI組大鼠骨小梁體積密度BV／TV 顯著降低，OEI組大鼠骨組織成骨細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Ⅰ型膠原蛋白（COL1）的基因相對表達(dá)量也明顯低于OE組，且破骨細(xì)胞標(biāo)志性酶抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的基因相對表達(dá)量明顯高于OE 組。同時，OEI組大鼠骨小梁體積密度BV／TV、COL1 的基因相對表達(dá)量和TRAP 的基因相對表達(dá)量與去卵巢安靜組（O 組）大鼠無顯著差異。這說明，跑臺運(yùn)動可顯著減緩大鼠去卵巢后骨質(zhì)的流失速度，提高去卵巢大鼠成骨細(xì)胞的成骨功能，同時降低去卵巢大鼠破骨細(xì)胞的破故功能，而注射一氧化氮合酶抑制劑L–NAME可使跑臺運(yùn)動對于骨代謝的調(diào)節(jié)作用減弱或消失。我們認(rèn)為，在體力活動中全身和局部增加釋放的一氧化氮，可能介導(dǎo)了運(yùn)動對骨代謝的影響作用。有研究表明［29］，一氧化氮可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，而這或許就是運(yùn)動調(diào)節(jié)骨代謝的機(jī)制之一。同時，我們的研究還表明，一氧化氮抑制劑不僅抑制了去卵巢大鼠成骨細(xì)胞的成骨作用，而且增強(qiáng)了破骨細(xì)胞的骨吸收作用。

4 結(jié) 論

4.1 跑臺運(yùn)動可增加去卵巢大鼠骨組織的成骨作用并降低其骨吸收作用，減緩大鼠去卵巢后的骨質(zhì)流失。

4.2 NO 介導(dǎo)了跑臺運(yùn)動對于去卵巢大鼠骨代謝的調(diào)節(jié)作用，注射一氧化氮合酶抑制劑L– NAME 可阻止跑臺運(yùn)動對于骨代謝的調(diào)節(jié)作用。

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