針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠外周血清IL－1β、IL－6表達的影響*

張亞敏，陳素輝，孫 華△，徐 虹，包 飛，王道海，高 揚

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院，北京100730;2.北京協和醫學院基礎醫學研究所，北京100005)

缺血性腦血管病屬中醫“中風”范疇。多年來，針刺治療腦血管病取得了良好療效。研究顯示電針能促進腦缺血大鼠缺血區血管再生，增加腦血流量，減輕缺血區細胞凋亡[1－2];且能調節腦缺血再灌注區基質金屬蛋白酶－9(MMP－9)及細胞間黏分子－1(ICAM－1)等炎癥損傷相關細胞因子的表達，減輕缺血再灌注后的腦水腫和腦組織損傷[]。外周血是機體宏觀調節信號的有效載體，通過檢測外周血中相關信號的變化可以反映腦組織局部的炎癥損傷程度及機體對局部損傷和損傷修復相關調節網絡的變化。研究表明針刺百會和足三里穴能夠影響腦缺血再灌注損傷大鼠外周血清蛋白的表達，干預其生理病理過程[4]。本研究通過酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測大鼠外周血清中白細胞介素1β(IL－1β)、白細胞介素6(IL－6)的表達，探討針刺百會和足三里穴在腦缺血再灌注損傷炎癥調節機制中的可能作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠，清潔級，體重260～310 g，10～12周齡，中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供[實驗動物證書:SCXK(京)2009－0017]。飼養條件:每籠5 只，光照:黑暗 =12 h∶12 h，室溫(25 ±3)℃，濕度75%，自由進食和飲水。實驗動物操作參照實驗動物研究指南。

1.2 主要試劑和器材設備

2636－4A、2634－4A線栓(北京沙東生物技術公司);長城牌KWD－808Ⅱ全能脈沖電療儀(常州市武進長城醫療器械有限公司);漢醫牌一次性無菌針灸針(天津華鴻醫材有限公司);全自動多功能酶標儀(美國Thermo公司);雙抗體夾心IL－1β ELISA試劑盒，雙抗體夾心IL－6 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司);漩渦混合器(北京北德科學器材有限公司)。

1.3 模型制備和神經功能評分

模型制備參考Longa等[5]的線栓法。線栓插入2 h后拔出以實現再灌注，待大鼠蘇醒對其行神經功能評分，判斷造模是否成功。神經功能評分依據Bederson等[6]的5級分類法:0級:神經功能無缺損;1級:左前肢不能完全伸展;2級:左前肢屈曲，向左側推動時阻力下降;3級:爬行時向左側轉圈;4級:意識不清，包括24 h內死亡。將0級和4級剔除實驗。

1.4 實驗分組與處理

將實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組和針刺組3個大組，每大組按照缺血再灌注后時間分成12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 和144 h共6 個亞組，每亞組8 只大鼠;另外設正常對照組8只。假手術組模擬手術損傷，分離至頸內、外動脈，不插入線栓，縫合，不治療;模型組造模成功后不治療;針刺組造模成功后，定位百會和足三里穴[7]，消毒后進針，針柄連接脈沖電療儀，疏密波，強度 2 mA，頻率 2～100 Hz，日 1次，每次20 min;正常對照組作為空白對照，不施手術，不治療。

1.5 IL －1β、IL －6 測定

各組大鼠按規定時間點用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血，室溫靜置 2 h，離心(3 500 rpm，20 min)，分離血清，分裝血清，存放于－80℃冰箱中備用。取備用血清用ELISA法測IL－1β、IL－6值，具體操作嚴格遵循試劑盒說明。

1.6 ELISA數據讀取與分析

在酶標儀450 nm處測OD 值，對標準品的OD值及其相應的已知濃度，做相關分析。然后以OD值為橫坐標，濃度為縱坐標，做一條標準曲線，并得出R2(相關系數)值和求解樣品濃度的公式，計算樣品濃度。本數據為計量資料，滿足正態性和方差齊性，采用單因素方差分析(one－way ANOVA)對數據進行統計學分析，組間比較應用LSD－t檢驗，所有數據用均數±標準差(xˉ±s)表示，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 實驗結果

2.1 各組大鼠外周血清IL－1β表達的變化

IL－1β在模型組呈雙峰形表達，峰值時間分別為24 h和96 h。IL－1β在針刺組表達強度低于模型組，以24 h組和96 h組最顯著(P＜0.05);IL－1β在假手術組表達低于模型組，其中96 h組差異具有顯著性(P＜0.05)。見表1及圖1。

表1 實驗各組大鼠外周血清不同時間點IL－1β濃度值(±s)

表1 實驗各組大鼠外周血清不同時間點IL－1β濃度值(±s)

注:與模型組比較，☆P ＜0.05;與假手術組比較，△P ＜0.05;與正常組比較，*P ＜0.05。

12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h針刺組 8 81.88 ±16.9* 60.50 ±18.01☆△＊ 95.78 ±30.21 72.01 ±24.40* 96.21 ±37.29☆ 90.05 ±36.87組別 n*模型組 8 75.76 ±13.6* 118.02 ±45.24 88.98 ±54.23* 84.85 ±49.61* 157.23 ±19.36△ 67.51 ±4.32*假手術組 8 83.56 ±20.00*105.45 ±43.83 95.83 ±31.15 94.16 ±11.85 63.81 ±22.00* 86.47 ±22.69*正常組 8 123.05 ±58.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64 123.05 ±38.64

表2 實驗各組大鼠外周血清不同時間點IL－6濃度值(±s)

表2 實驗各組大鼠外周血清不同時間點IL－6濃度值(±s)

注:與模型組比較，☆P ＜0.05;與假手術組比較，△P ＜0.05;與正常組比較，*P ＜0.05。

12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h針刺組 8 39.02 ±4.54* 37.32 ±7.52△ 34.86 ±4.69☆△ 53.48 ±33.06* 41.23 ±6.83* 42.96 ±3.72組別 n*模型組 8 38.38 ±3.63* 40.87 ±5.55＊△ 39.77 ±3.55* 42.90 ±8.65 40.91 ±6.87* 43.29 ±11.46*假手術組 8 39.07 ±5.33* 49.83 ±3.40* 42.86 ±9.44* 52.66 ±14.39* 42.32 ±6.23* 43.92 ±5.04*正常組 8 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81 35.12 ±3.81

圖1 不同時間點各組大鼠外周血清IL－1β表達的變化

圖2 不同時間點各組大鼠外周血清IL－6表達的變化

2.2 各組大鼠外周血清IL－6表達的變化

IL－6在模型組的表達高于正常組(P＜0.05);IL－6在針刺組各時間點的表達低于模型組和假手術組，其中24 h和48 h組具有顯著性差異(P＜0.05)。IL－6在假手術組中呈雙峰形表達，峰值時間在24 h和72 h，假手術組各個時間點IL－6的表達高于模型組，但除24 h組外，其余時間點無統計學意義(P＞0.05)。見表2及圖2。

3 討論

缺血性腦卒中主要病機為臟腑陰陽失調，導致機體氣血逆亂，上犯腦竅，腦絡瘀阻而發病。根據中醫經絡理論，腦缺血后機體正氣不足，屬于積損正衰。百會穴屬督脈，位于巔頂，“頭者神之居”為“精明之府”，且督脈總督一身之陽，具有開竅醒神之功。足三里穴為足陽明胃經的合穴，陽明經多氣多血，臨床選穴有“治痿獨取陽明”原則。兩穴合用可疏經活絡、扶正祛邪以調節機體陰陽平衡。根據導師多年的臨床經驗和實驗總結，發現針刺百會和足三里穴在治療神經系統及免疫系統疾病等方面優勢顯著。

IL－1β在正常腦組織中低表達，腦缺血再灌注損傷后，由局部浸潤的單核－巨噬細胞、活化的星形膠質細胞和少突膠質細胞等分泌，可促進內皮細胞增殖并表達粘附分子，募集白細胞，刺激單核－巨噬細胞產生TNF －a、IL－6等細胞因子，加重局部炎癥反應[8]。還可通過上調基質金屬蛋白酶表達水平破壞血腦屏障[9]，進而使中樞腦組織的炎癥反應信號通過血液傳遞至外周，活化外周免疫系統中的炎性細胞;同時可募集外周炎性細胞至中樞損傷腦區，參與中樞損傷及損傷修復過程。腦缺血再灌注后24 h，外周血炎性細胞因子(如IL－1β、IL－6)大量表達于粘附分子和趨化因子等可募集炎癥細胞，移行至缺血損傷區，進一步破壞血腦屏障，加重局部神經元壞死，擴大炎癥反應[10]。

IL－6在腦缺血急性期是重要的炎癥介質，可導致腦炎性損傷，但在腦缺血亞急性期IL－6通過連同白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)及睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)等發揮神經保護作用[11]。且外周血中的IL－6水平是反應腦缺血損傷早期的靈敏性指標，研究[12]顯示，MCAO模型中IL－6在外周血2 h即開始上升，早于腦組織開始上升時間(24 h)。

本研究顯示，腦缺血再灌注損傷后，模型組大鼠外周血清中的IL－1β在缺血再灌注24 h后出現第1個峰值，該峰值信號一般反映炎癥的損傷程度，96 h達到第2個峰值，由于中后期峰值的表達通常由早期的損傷信號和中后期的損傷修復信號疊加形成，故后者強度高于前者。本實驗中，假手術組大鼠外周血清的IL－6表達高于模型組，國外研究[]中亦發現有相似結果。腦缺血再灌注模型是一種高強度的病理性應激反應，損傷應激程度高于假手術組，考慮是模型組釋放的兒茶酚胺類和糖皮質激素等應激激素較假手術組多，而這些激素可抑制免疫系統的應答活化，減少免疫細胞因子的表達，故模型組的IL－6表達水平低于假手術組。實驗中正常組大鼠外周血清IL－1β表達較模型組高，尚未找到有關證據支持，考慮外周血影響因素較多，這種情況可能由于實驗誤差導致，有待進一步探討。

本研究觀察到，腦缺血再灌注早期，針刺組大鼠外周血清炎性細胞因子IL－1β、IL－6的表達低于未經干預的腦缺血模型組;腦缺血中后期，隨著炎癥損傷反應的抑制，針刺組大鼠外周血清中的IL－1β表達強度低于模型組，而IL－6表達上升，提示針刺百會、足三里穴在腦缺血損傷早期可能通過下調外周血清IL－1β、IL－6的表達抑制炎癥反應，腦缺血損傷中后期可能通過上調IL－6的表達促進腦組織的損傷修復，發揮腦保護作用。

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