趨化因子受體CCR7在乳腺癌細胞株上的表達及意義

郭滿盈，張 茵，羅雪平，陳 揚，王 棟

（解放軍第98醫院1.檢驗科；2.院部，浙江 湖州313000；3.第二軍醫大學解剖學教研室，上海200433）

多種趨化因子及其受體與惡性腫瘤的生長、浸潤及轉移有關，乳腺癌等多種腫瘤細胞表面有CCR5、CXCR4等趨化因子受體的表達，而且所表達趨化因子受體的不同可能與特定靶器官的定向轉移有關［1－2］。趨化因子受體CCR7是否參與乳腺癌轉移，作用如何，尚無定論。本組對乳腺癌細胞株MDA－MB－361上CCR7的表達進行了檢測，為乳腺癌細胞轉移機制的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 乳腺癌細胞株 MDA－MB－361由第二軍醫大學解剖學教研室常規傳代培養。

1.1.2 主要試劑 Trizol RNA提取試劑盒，購自Life Technologies公司；CCR7mRNA引物由上海生物工程公司合成；M－MLV 逆轉錄酶、DTT、DEPC等購自 Gibco公司；Oligo－dT15購自Promega公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs購自TakaRa公司；鼠抗人CCR7mAb購自RD公司；免疫組化用第二抗體試劑盒購自美國LABvision公司。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌細胞株CCR7mRNA的檢測 取1×106乳腺癌細胞，按照Trizol RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA，取6μg總RNA與0.5μg oligodT15混合，逆轉錄獲得cDNA。以其作為模板，PCR擴增CCR7中一大小為530bp的片段，所用的上游引物為5′－TCCTTCTCATCAGCAAGCTGT－3′，下游引物 為 5′－GAGGCAGCCCAGGTCCTTGAAG－3′。具體反應步驟為：37℃ 1h，72℃ 5 min，完成逆轉錄；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環完成PCR后，再72℃充分延伸10min。以人GAPDH作為內對照，其上游引物為5＇－GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG－3＇，下游引物為5＇－CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC－3＇，大小為788bp。擴增產物進行1.5g／L瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH作為內對照，凝膠成像掃描儀分析，比較乳腺癌細胞中CCR7的相對表達量。

1.2.2 乳腺癌細胞株CCR7蛋白的檢測 干凈的蓋玻片放入培養皿中，使細胞貼壁在蓋玻上，培養24h，取出蓋玻片，經PBS洗后，用4%多聚甲醛固定30min，85%、95%和100%乙醇脫水，用中性樹脂將蓋玻片無細胞面貼在載玻片上，經風干后可做免疫組化。主要步驟如下：①0.3%H2O2室溫反應20min，或3%H2O2室溫反應5min，用以清除內源性過氧化物酶反應，PBS浸泡5min。② 加工作濃度的一抗（約10μg／ml），37℃，1h，PBS沖洗3×3min。③ 加生物素化羊抗鼠IgG，37℃，30min，PBS沖洗3×3min。④ 加Streptavidin－HRP，37℃，30min，PBS沖洗3×3min。⑤ DAB染色，5－10min，水洗。⑥ 蘇木素襯染，樹脂封片，鏡檢。陽性結果判斷為細胞膜、漿上呈棕褐色，背景為淡藍色。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞株CCR7mRNA的表達 通過RT－PCR法能從乳腺癌細胞株 MDA－MB－361中擴增出GAPDH基因片段和CCR7中選定的基因片段，以GAPDH作為內對照，凝膠成像掃描儀分析，比較乳腺癌細胞中CCR7的相對表達量為1.56，見圖1。

圖1 乳腺癌細胞株CCR7mRNA的表達（條帶1）

2.2 乳腺癌細胞株CCR7的蛋白表達 免疫組化法檢測到乳腺癌細胞株 MDA－MB－361細胞膜、細胞漿上有CCR7的蛋白表達，見圖2。

圖2 乳腺癌細胞株細胞膜、細胞漿上CCR7的蛋白表達（200×）

3 討論

CCR7早先稱為孤兒受體EBI1，最初是由于B細胞感染EB病毒而被發現，在幼稚T細胞（naive T）、B細胞及樹突狀細胞（dendritic cells，DC）表面表達，隨DC的成熟，CCR7的表達也上調。CCR7及其配體CCL19、CCL21在淋巴器官的生長發育以及淋巴細胞、樹突狀細胞向淋巴結的歸巢中發揮重要的作用［3］。Muller等［4］首次提出腫瘤細胞利用趨化因子受體與其配體的特異性結合而實現靶向性轉移的理論，乳腺癌細胞可能利用與淋巴細胞、樹突狀細胞向淋巴結歸巢一樣的機制，即通過細胞表面的CCR7和淋巴結表達的CCL19、CCL21特異性結合來實現向淋巴結的轉移。

本檢測結果表明，乳腺癌細胞系MDA－MB－361高表達CCR7，其高表達可為下一步的實驗研究打下基礎。本組也曾發現乳腺癌組織中有CCR7的表達，而且在原位癌組織與發生轉移癌組織中其表達率無顯著性差異，說明CCR7在乳腺癌發生的早、中期就可能發揮作用［2］。

CCR7在癌細胞轉移動態過程中具體作用尚待進一步探討，對高表達CCR7的乳腺癌細胞系的進一步實驗研究可能會有助于更多機制的發現。

［1］吳高松，馬小鵬，劉巖巖，等.趨化因子SDF－1a生物半衰期預測乳腺癌術后復發及轉移［J］.中華普通外科雜志，2010，25（11）：907.

［2］郭滿盈，羅媛燁，陳 揚，等.趨化因子受體CCR6及CCR7在乳腺癌組織上的表達與意義［J］.國際檢驗醫學雜志，2009，30（1）：28.

［3］楊銀龍，歐周羅，邵志敏.CCL19／21－CCR7生物學軸與腫瘤轉移［J］.國際腫瘤學雜志，2006，33（8）：564.

［4］Muller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature，2001，410（6824）：50.