綿羊呼吸道病原菌分離及藥敏試驗

張克山，劉永杰，孔漢金，尚佑軍，逯忠新，劉湘濤

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室國家口蹄疫參考實驗室，甘肅 蘭州730046）

近年來迫于環(huán)境和資源的雙重壓力，我國肉羊飼養(yǎng)由牧區(qū)向農(nóng)區(qū)和南方草山草坡地區(qū)擴展轉(zhuǎn)移已成必然之勢。由于飼養(yǎng)環(huán)境和養(yǎng)殖方式的改變，羊病發(fā)生的風險將會大增，呼吸系統(tǒng)疾病上升并已成為制約肉羊規(guī)模化飼養(yǎng)進程的主要因素之一［1］。隨著抗菌藥物在集約化羊場的廣泛使用，不可避免地導致細菌對藥物產(chǎn)生耐藥性，這一現(xiàn)實無疑增加了羊場疫病防控的難度。為了解和掌握規(guī)模化羊場呼吸道細菌感染情況以及耐藥程度，為指導臨床用藥提供依據(jù)，本試驗對甘肅某規(guī)模化羊場發(fā)生的呼吸系統(tǒng)疾病進行了細菌分離培養(yǎng)、藥敏試驗和臨床效果觀察。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2011年3月甘肅河西某規(guī)模化羊場發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難，病料采自該羊場典型發(fā)病羊的肺臟組織，低溫送到實驗室待檢測。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA），小牛血清，無菌輔酶Ⅰ（NAD），16種常見藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。用于分離細菌的培養(yǎng)基為TSA中加入5%小牛血清和適量NAD。

1.3 細菌分離 將采集的綿羊肺臟組織，表面徹底消毒后，剪取內(nèi)層無菌接種于1.2中配置好的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h后用無菌生理鹽水（每個培養(yǎng)皿約2mL），沖洗細菌。將細菌懸液均勻涂布于新的1.2配置的培養(yǎng)基，待干燥后貼藥敏紙片。

1.4 藥敏試驗 采用K－B紙片瓊脂擴散法進行［2］，按臨床實驗室標準研究所（CLSI）2010年標準判斷結(jié)果。

1.5 藥敏試驗驗證 根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，使用最敏感藥物和次最敏感藥物交替使用，觀察羊群治療效果，驗證藥敏試驗和臨床使用效果是否相符。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離 可見為邊緣整齊、圓形、表面光滑濕潤、中等大小、灰白色半透明的菌落（圖1）。

圖1 分離菌株的培養(yǎng)特征

2.2 藥敏試驗 藥敏紙片貼好后放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～16h，觀察測量抑菌圈的大小（圖2）。抑菌圈直徑等于0為不敏感；0～10mm為低度敏感；10～14mm為中度敏感；15～20mm為高度敏感；大于等于20mm為極度敏感［3］，分離的細菌對16種藥物的藥敏試驗結(jié)果見表1。

圖2 抑菌圈大小測定

2.3 治療效果 使用先鋒霉素Ⅴ和復方新諾明兩種藥物，按著說明書使用劑量交替用藥，15d后羊場呼吸系統(tǒng)疾病基本控制，無新發(fā)病例，發(fā)病羊的治愈率90%以上，死亡率為0。

表1 分離菌株的藥物敏感性試驗

3 討論

規(guī)模化、集約化養(yǎng)羊使得羊群密度增加，冬春季節(jié)出于保暖的需要，羊場的密閉性增加，使得呼吸系統(tǒng)疾病日益嚴重［4］。由于缺乏臨床指導性用藥，使得藥物的種類在臨床上越用越多，使用時間越來越長，這一現(xiàn)場除了導致藥物殘留外更重要的是耐藥菌株越來越多，治療效果越來越不理想。

從本試驗的結(jié)果看，16種藥物中沒有極度敏感藥物，先鋒霉素Ⅴ是高敏感藥物，四環(huán)素、環(huán)丙沙星、強力霉素、氟苯尼考、復方新諾明5種藥物為中度敏感藥物，其他10種為低度敏感藥物。從藥敏試驗指導臨床用藥效果看，藥敏試驗取得了預期的使用效果，建議羊場，使用藥物保健［5］，采取預防為主、防重于治，交叉用藥，合理用藥的方針進行羊場呼吸系統(tǒng)病原菌的預防和治療。

實際應用時，由于條件的限制，羊場簡易的試驗設(shè)備無法進行分離細菌的純化培養(yǎng)、致病性試驗和生化鑒定，而呼吸系統(tǒng)感染往往是混合感染。因此，最簡單實用的方法是對分離的所有細菌混合后進行藥敏試驗，更接近于生產(chǎn)實際。

［1］ 張克山，尚佑軍，叢國正，等.關(guān)于當前我國肉羊產(chǎn)業(yè)疫病防控現(xiàn)狀的調(diào)研［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（4）：20－21.

［2］ 桂炳東，孫敬，徐建民.細菌藥物敏感性試驗測定手冊［M］.南昌：江西科學技術(shù)出版社，2001：28－29.

［3］ 冷闖，張文波，鄧舜洲，等.一例梅花鹿致病菌的分離、鑒定及藥敏試驗［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（4）：207－211.

［4］ 金國良，李濤.舍飼羊衛(wèi)生保健的常規(guī)程序［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2007（9）：43.

［5］ 楊建軍，田立春，王阜生.也談舍飼羊的日常保健技術(shù)［J］.中國畜禽種業(yè)，2009（12）：29.