兔纖維素性肺炎中大腸桿菌的分離與鑒定

王 開，裴志花

（吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春130118）

隨著我國家兔產業的迅速發展，養兔業呈現規模化、集約化發展的趨勢。然而，一旦兔舍通風問題處理不好，造成舍內有害氣體如氨氣、硫化氫、二氧化碳等濃度上升，呼吸道疾病時有發生。例如，某兔場種兔發病率約18%，臨床表現為咳嗽、打噴嚏，嚴重者呼吸困難，病兔逐漸消瘦，食欲減退，出現不同程度的死亡現象。剖檢變化：主要表現為氣管內有少量泡沫樣液體，肺臟表面包裹一層纖維素樣滲出物。為了盡快控制疾病，我們對送檢兔進行了病原菌的分離與鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 血清瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍培養基、S.S.培養基、加犢牛血清的LB液體培養基，由本實驗室制備；藥敏紙片，購自杭州天和微生物制劑有限公司；ExTaqTMDNA聚合酶，DL－2 000TMDNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；基因組提取試劑盒，購自北京三博遠志生物技術有限責任公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自長春華大中天生物技術有限公司。

1.2 細菌分離培養 取病死兔的肺、肝臟、心血，接種普通瓊脂培養基、血清瓊脂培養基，挑取優勢單一菌落，分別接種于麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍培養基、S.S.培養基，置37℃恒溫培養20h，直至得到菌落形態和鏡檢菌體形態一致的純培養物。

1.3 染色鏡檢 將分離到的細菌進行革蘭染色、鏡檢。

1.4 小鼠接種試驗 將細菌接種于普通LB液體培養基，置37℃恒溫培養20h。試驗組小鼠2只，對照組小鼠2只。試驗組小鼠腹腔注射LB液體培養菌液（菌液濃度均調整到8×1010CFU/mL），每只0.5mL，對照組小鼠腹腔注射LB液體培養液，每只0.5mL。觀察發病及死亡情況，對死亡小鼠剖檢、細菌分離培養、染色鏡檢。

1.5 16SrRNA V3可變區基因擴增及測序 從平板上挑取少許單一菌落，移入LB液體培養基擴大培養，取對數生長期新鮮菌液，離心收集菌體，用細菌基因組DNA提取試劑盒抽提細菌的基因組DNA。16SrRNAV3可變區基因擴增引物為通用引物1492R/27F，序列如下：1492R：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′；27F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′

反應體系為50μL，于0.2mL滅菌無酶PCR管內依次加入：10×PCR Buffer 5μL，dNTP（2.5 mmol/L）4μL，MgCl24μL，滅菌雙蒸水28μL，基因組DNA 5μL，上下游引物各1μL，ExTaqDNA聚合酶2μL。

擴增條件：94℃ 2min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃45s，35個循環，72℃延伸10min。

取5μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用DNA Marker作為參照。反應產物的純化根據膠回收試劑盒的操作說明進行，回收產物用1%瓊脂糖電泳檢測，并送寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定。測序結果在GenBank數據庫中進行Blast分析比對，用DNAStar軟件對相近序列進行同源性分析，構建系統發育樹。

1.6 藥敏試驗 將分離到的菌株，采用瓊脂擴散法（K－B法）進行常用抗菌類藥物的敏感性試驗，置37℃恒溫培養20h取出，以抑菌圈直徑作為判定指標，判斷標準依據美國臨床標準委員會（NC－CLS）手冊2005版。

2 結果

2.1 細菌分離培養結果 結果只有接種肺臟病料的培養基上出現細菌生長，在瓊脂培養基上長出直徑約1～2mm的菌落，菌落較大，呈乳白色、光滑、濕潤、凸起。麥康凱瓊脂培養基上出現紅色菌落，S.S.培養基上出現紅色菌落，伊紅美藍培養基上出現金屬光澤的菌落，LB液體培養基呈均勻渾濁。

2.2 染色鏡檢結果 細菌呈革蘭陰性的桿菌，結合伊紅美藍鑒別培養基的結果，初步認為該菌是大腸桿菌（E.coli）。

2.3 小鼠接種試驗結果 普通LB液體培養菌液接種小鼠，試驗組小鼠24h內全部死亡，對照組小鼠健活。將死亡小鼠的心血進行細菌分離培養、革蘭染色鏡檢，獲得與接種菌完全相同的細菌。

2.4 16SrRNA V3可變區基因擴增及菌落PCR鑒定結果 由圖1可見，擴增出了該菌16SrRNA V3可變區約為1 700bp的特異性條帶，膠回收后電泳，可見清晰的目的條帶（圖2）。

圖1 16SrRNA V3區基因PCR擴增

圖2 陽性克隆菌落PCR鑒定結果

2.5 測序結果及系統發育分析 采用1 492R引物單向測序，測序結果如下。

測序結果在NCBI GenBank數據庫中進行Blast分析比對，發現與其匹配度最高的幾種序列均是大腸桿菌各菌株系的16SrRA序列，其匹配度均高達99%以上。用DNAStar軟件將分離菌的序列與選取的6株核苷酸同源性較高的大腸桿菌16SrRNA序列進行同源性分析，構建系統發育樹（圖3）和核苷酸相似性分析圖（圖4），結果顯示，該菌株與6個代表菌株的同源性均在99%以上，從分子水平證明該菌是大腸桿菌。

2.6 藥敏試驗 結果表明，本菌對磷霉素鈉、頭孢噻肟最敏感。

結果見表1。

表1 細菌藥敏試驗

3 分析與討論

引起兔呼吸道癥狀的病原菌常見于巴氏桿菌和波氏桿菌，鑒于巴氏桿菌在普通培養基上難生長的情況，本試驗使用了血清瓊脂培養基，保證細菌能夠較好生長。而篩選到的致病菌菌落較大，且在麥康凱瓊脂培養基上能夠生長，在伊紅美藍培養基上出現金屬光澤，初步證明該菌是大腸桿菌。為進一步驗證該菌，進行了該菌的16SrRNA的擴增及序列測定，從分子水平證明該菌為大腸桿菌。藥物敏感試驗結果表明，該菌對青霉素、四環素、復方磺胺類藥物呈現不同程度的耐藥性，這可能與生產單位長期濫用抗生素有關；而對磷霉素鈉、頭孢噻肟等最為敏感，可用于疫病的早期治療。而人類大腸桿菌肺炎的治療結果表明，抗生素耐藥性存在變遷并逐步上升［1］，從科學的角度講，不同兔場還是以本場的抗菌譜為準。

細菌中rRNA高度保守，16SrRNA序列分析進行細菌鑒定已經是國際上通用的鑒定技術［2－3］，一般認為，16SrRNA序列同源性為99%～100%，判定為同一個種，97%～99%的同源性，判定為同一個屬［4－5］。根據此標準，從 NCBI數據庫得到的16S rRNA序列比對結果表明，該菌與大腸桿菌的同源性均高達99.8%，從分子水平上證明該菌為大腸桿菌。由構建的系統進化樹和核苷酸相似性分析結果可知，JF895181（兒童腹瀉樣本，印度株）、JF910107（小孩腹瀉物，印度株）、JN180963（牦牛糞便，四川株）、JN547259（綿羊糞便，河南株）、JN578647（綿羊糞便，河南株）均來源于腹瀉樣品。普通大腸桿菌正常條件下不致病，但是當機體抵抗力下降時，致病性大腸桿菌可通過血源性散播、內源性吸入和外源性吸入3種方式感染其他器官，包括肺。本試驗發現，發病兔沒有消化道疾病癥狀，僅表現呼吸道疾病癥狀，說明致病菌可能來源于外源性吸入。

大腸桿菌是家兔腸道主要致病菌，也是生產中經常分離培養到的致病菌之一，有關此方面的報道也屢見不鮮，但多限于從腸道、腸系膜淋巴結和肝分離到本菌［6－7］，也有大腸桿菌引起兔出血性肺炎［8］的報道，能引起纖維素性肺炎的報道尚未見到。但本試驗從肺臟中分離到致病性大腸桿菌，且發病兔未見消化道癥狀，說明病原菌因腸道感染經血液循環轉移至肺部引起肺炎的可能性較低。間接說明，大腸桿菌可能直接感染呼吸道引起肺部出現纖維素性肺炎。總之，在臨床實踐中，大腸桿菌引起的纖維素性肺炎應引起注意，且治療得越早，病情越容易控制。

［1］ 鄭楚玉，林章禮.呼吸道產超廣譜β－內酰胺酶大腸桿菌肺炎克雷伯氏菌感染及耐藥變遷［J］.實用醫技雜志，2004，11（8）：1425－1427.

［2］ 劉紅芹，朱瑞良，胡曉娜，等.禽波氏桿菌分離株的16SrRNA基因序列分析［J］.中國獸醫學報，2008，28（1）：32－34.

［3］ 師福山，趙德明.禽大腸桿菌的分離與16SrRNA的鑒定［J］.中國畜牧獸醫，2009，36（6）：111－113.

［4］ Drancourt M，Bollet C，Carlioz R，etal.16Sribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates［J］.J Clin Microbiol，2000，38（10）：3623－3630.

［5］ Janda J M，Abbott S L.Bacterial identification for publication：when is enough enough［J］.J Clin Microbiol，2002，40：1887－1891.

［6］ 李國立，邢蘭君.兔大腸桿菌病的診治［J］.中國獸醫雜志，2011，47（6）：83.

［7］ 黃紅梅，劉梅，吳健敏.兔大腸桿菌的分離、鑒定及藥敏試驗［J］.黑龍江畜牧獸醫，2012，47（3）：22－24.

［8］ 赫曉燕，劉晉平，馬海利.獺兔大腸桿菌性出血肺炎的診治［J］.畜牧獸醫雜志，2000，19（4）：7－8.