應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定豬源隱秘桿菌的感染

禤雄標(biāo)，李 軍，胡 帥，陳澤祥，楊 威，許力干，玉華琳

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧530001；2.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530001；3.玉林博白縣三元?jiǎng)颖７?wù)部，廣西 玉林537600）

隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes，A.pyogenes），又名化膿放線桿菌，是一種多形態(tài)、無運(yùn)動(dòng)性的革蘭陽性桿菌。Ramos［1］根據(jù)16SrRNA基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析后將其分類到隱秘桿菌屬。該菌常導(dǎo)致牛［2］、羊［3］和豬發(fā)?。?］，表現(xiàn)為肺炎、關(guān)節(jié)炎［5－6］等。近年來，豬場發(fā)病的病因及病原致病機(jī)理呈復(fù)雜趨勢，尤其斷奶仔豬肺炎和腿部疾病也越來越明顯，不但影響豬的生長性能，而且降低肉豬的商品價(jià)值。2011年7月～2012年3月，廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室在開展副豬嗜血桿菌病流行病學(xué)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，廣西南寧市、貴港市和玉林市分別有3個(gè)規(guī)模豬場斷奶仔豬零星出現(xiàn)以體溫升高、關(guān)節(jié)炎、少量淡黃色稀薄膿汁、心包炎，部分死亡小豬肺部有小壞死灶為主要特征的疾病，臨床癥狀與副豬嗜血桿菌病、鏈球菌病相似。此外，南寧市和貴港市的兩個(gè)豬場曾免疫過副豬嗜血桿菌商品苗，但免疫效果不佳。最后，經(jīng)過PCR鑒定確診3起病例均由豬源隱秘桿菌引起，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料來源 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基，購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；5%兔血瓊脂培養(yǎng)基和5%兔血牛腦心肉湯增菌培養(yǎng)基，自配；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），購自北京索萊寶科技有限公司；馬血清，購自美國Hyclone公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司；PCRTaqMix、DNA Marker 2，購自廣東東盛生物科技有限公司。按文獻(xiàn)［7］合成細(xì)菌16SrRNA基因通用引物、副豬嗜血桿菌16SrRNA基因［8］、隱秘桿菌16S rRNA引物［9］和隱秘桿菌溶血素基因（Pyolysi，PLO）［10］、豬繁殖與呼吸綜合征病毒［11］和豬圓環(huán)病毒2型［12］。材料來源為臨床表現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大或有纖維素性滲出物的規(guī)模豬場送檢材料。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離和鑒定 用無菌接種環(huán)沾取肺纖維滲出物、化膿灶或關(guān)節(jié)液接種在含0.05%NAD和5%馬血清的TSA培養(yǎng)基、KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基、5%兔血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，置于37℃、5% 的CO2中培養(yǎng)，24～48h后觀察細(xì)菌生長；取均一優(yōu)勢生長的菌落待鑒定。

1.2.2 病毒和細(xì)菌PCR檢測 無菌刮取在兔血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好的純培養(yǎng)物，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總DNA，－20℃保存或直接用于PCR檢測。

無菌采集發(fā)病/病死豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)約1g，勻漿、凍溶3次，8 000r/min離心5min；取上清液按病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書操作。所得病毒DNA/RNA用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型，各引物PCR反應(yīng)按文獻(xiàn)［11］、［12］進(jìn)行。電泳后PCR反應(yīng)產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 取16h的細(xì)菌純培養(yǎng)物，按常規(guī)紙片法測定常用抗菌藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離和鑒定結(jié)果 將病（死）豬的關(guān)節(jié)液、肺臟纖維滲出物接到5%兔血瓊脂培養(yǎng)基，分離到以微小而圓、微隆起、半透明、周圍有明顯的β溶血現(xiàn)象的菌落；革蘭染色為陽性呈球狀、桿狀或棒狀、單在、成叢或柵欄樣排列、著色不勻。莢膜和芽孢染色后鏡檢，未發(fā)現(xiàn)莢膜和芽孢結(jié)構(gòu)。

2.2 PCR檢測結(jié)果 用細(xì)菌16SrRNA通用引物、隱秘桿菌16SrRNA引物以及隱秘桿菌溶血素基因（PLO）均能擴(kuò)增出目的片段，而副豬嗜血桿菌16SrRNA引物均為陰性，見圖1。

應(yīng)用豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型引物分別對3份病料進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果南寧某豬場、玉林某豬場、貴港某豬場3個(gè)豬場豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒2型全為陽性。

2.3 3株豬源隱秘桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 見表1。由表1可知，3個(gè)分離菌株對阿奇霉素、左氧沙星和頭孢噻呋表現(xiàn)為高敏；對泰樂菌素、阿米卡星和強(qiáng)力霉素表現(xiàn)為中敏；對慶大霉素、磺胺嘧啶鈉和阿莫西林表現(xiàn)為不敏感，而其余4種藥物對3個(gè)不同菌株表現(xiàn)出不同敏感性。

圖1 隱秘桿菌PCR鑒定電泳圖

表1 13種臨床常用藥物敏感試驗(yàn) （抑菌圈mm）

3 分析與討論

近年來，由于養(yǎng)豬模式高度集約化以及一些免疫抑制因素對免疫系統(tǒng)的侵襲，導(dǎo)致豬場細(xì)菌性疾病仍然很嚴(yán)重，病癥和病程也越來越復(fù)雜。目前，臨床上能引起豬肺臟纖維滲出物或腿關(guān)節(jié)腫脹為主要癥狀的病原有慢性鏈球菌病、傳染性胸膜肺炎、放線桿菌病、副豬嗜血桿菌病、豬鼻支原體?。?3］和葡萄球菌病等，而化膿放線菌作為豬滲出性肺炎或關(guān)節(jié)腫脹的直接發(fā)病病原，在國內(nèi)也逐漸引起關(guān)注。豬化膿放線菌既可由外傷和呼吸道感染引起豬化膿放線菌既可由外傷感染引起，也可由呼吸道感染引起，在免疫抑制因素的作用下導(dǎo)致嚴(yán)重的全身并發(fā)癥。本次試驗(yàn)共分離到3株病原菌，經(jīng)染色形態(tài)、菌落特征和PCR鑒定，判定為豬源隱秘桿菌。

一般情況下，內(nèi)源性病原菌能被正常菌群拮抗，不能大量繁殖，很少表現(xiàn)毒力，但在應(yīng)激因素、免疫抑制疾病或缺乏某些維生素導(dǎo)致豬體免疫系統(tǒng)功能不健全時(shí)，內(nèi)源性病原菌就大量繁殖，毒力增強(qiáng)。本次試驗(yàn)分離得到的3個(gè)菌株在臨床初期也表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎，而后期導(dǎo)致全身感染，提示這些分離菌株對豬都有較強(qiáng)致病力，而分離菌株的致病機(jī)理也有待進(jìn)一步研究闡明。此外，為了解以豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型為主導(dǎo)的免疫抑制性疾病與該菌在流行病學(xué)上的關(guān)系，本次試驗(yàn)在分離細(xì)菌的同時(shí)，檢測發(fā)病豬樣品中豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型帶毒情況，結(jié)果表明，所有分離出豬源隱秘桿菌的病料均感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型。這說明豬源隱秘桿菌導(dǎo)致豬群發(fā)病也與豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型的感染有密切關(guān)聯(lián)。眾所周知，豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要侵襲肺泡巨噬細(xì)胞，而豬圓環(huán)病毒2型則侵害全身淋巴細(xì)胞，若單獨(dú)或混合感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型，豬體免疫機(jī)能均急劇下降，豬源隱秘桿菌得以暴發(fā)式繁殖，從而導(dǎo)致豬群發(fā)病。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型均為陽性的這3個(gè)豬場，在加強(qiáng)豬繁殖與呼吸綜合征病疫苗和豬圓環(huán)病毒2型疫苗免疫的2個(gè)月后，豬場生產(chǎn)狀況逐步進(jìn)入良性循環(huán)：母豬繁殖障礙現(xiàn)象、斷奶仔豬衰竭綜合征以及肺炎和腿部關(guān)節(jié)腫大等病癥逐漸減少。這也側(cè)面說明只有加強(qiáng)這兩個(gè)免疫抑制性疾病的防控，細(xì)菌性疾病才容易解決。

目前，對豬源隱秘桿菌的鑒定主要采用細(xì)菌分離培養(yǎng)，但該菌在血平板上需要36h以上才長出明顯菌落，再進(jìn)行生化和藥敏試驗(yàn)等，將花費(fèi)4～5天時(shí)間，錯(cuò)過用藥最佳時(shí)機(jī)。因此，本試驗(yàn)針對豬源隱秘桿菌16SrRNA和溶血素（PLO）基因合成兩對特異性引物，建立豬源隱秘桿菌PCR檢測方法，為確診該病提供便捷手段。研究證明，溶血素基因（PLO）是豬隱秘桿菌的主要毒力和抗原基因，該基因可用作豬隱秘桿菌的臨床鑒定。溶血素屬于膽固醇依賴性溶細(xì)胞素（CDC）家族，具有溶解各種動(dòng)物血細(xì)胞的能力，包括多形核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。本次試驗(yàn)分離到的3個(gè)菌株，檢測溶血素基因（PLO）均為陽性，結(jié)合臨床發(fā)病癥狀證明，這3個(gè)分離菌株都具有較強(qiáng)致病性。

目前，對豬隱秘桿菌的防治仍以藥物治療為主。3個(gè)分離菌株經(jīng)過PCR鑒定、藥物敏感試驗(yàn)，根據(jù)各場分離菌株對藥物敏感差異性，選擇阿奇霉素、左氧氟沙星和頭孢噻呋等進(jìn)行防治，實(shí)施藥物保健20 d后，3個(gè)豬場的肺炎和關(guān)節(jié)炎等癥狀逐漸減輕。但是，仍有部分嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎癥狀的病豬對藥物治療效果不理想，究其原因可能是藥物很難進(jìn)入關(guān)節(jié)腔以達(dá)到有效殺菌濃度，或由于膿腫特性阻止抗菌藥物對細(xì)菌殺滅，最終仍影響商品豬的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。抗生素的使用雖然能治療細(xì)菌病，但抗生素的選擇和使用方法不對也直接影響疫病的治療，導(dǎo)致細(xì)菌多重耐藥性不斷增強(qiáng)。希望豬場能確切診斷出病原才采取保健方案，切忌濫用、盲目用藥，延誤時(shí)間也容易產(chǎn)生病原耐藥性。

［1］ Ramos C P，F(xiàn)oster G，Collins M D.Phylogenetic analysis of the genusActinomycesbased on 16SrRNA gene sequences：description ofArcanobacteriumphocaesp novArcanobacteriumbernardiaecomb nov andArcanobacteriumpyogenescomb nov［J］.Int J Syst Bacteriol，1997，47：46－53.

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