中國白兔IL－6基因的克隆與序列分析

張夏蘭，陳 軍，王紅寧，楊 鑫，張安云

（1.四川農業(yè)大學動物科學院，四川 雅安625014；2.四川大學生命科學學院動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室，四川 成都610064；3.重慶市巴南區(qū)動物疫病預防控制中心，重慶 巴南401320；4.重慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，重慶 巴南401147）

白介素6是已知的功能最廣泛的細胞因子，作為一種重要的免疫調節(jié)劑，在細胞免疫中有廣譜性，在動物疾病的預防、治療和構建基因工程疫苗中顯示出廣闊的應用前景，在家兔上做白介素6的研究實屬必要。本試驗基于IL－6在免疫學方面特有的生物學活性，根據GenBank上登錄的兔IL－6的基因序列，結合人IL－6的基因序列，設計引物，從中國白兔的淋巴細胞RNA中擴增出IL－6基因。本試驗在國內尚屬首次，具有一定學術價值和應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料 1～2月齡的中國白兔，購自四川某肉兔場。RNA抽提試劑盒、反轉錄酶AMV、Oligo（dt）、RNA 酶 A、Taq酶、d NTP 、EcoRⅠ、HindⅢ、RNA酶抑制劑、T連接酶、質粒抽提試劑盒、載體pMD18－T、DNA Marker DL－2 000，均購自寶生物工程（大連）有限公司；ConA，購自Sigma公司；營養(yǎng)液1640，購自天泰公司，兔淋巴細胞分離液，購自天津市灝澤生物制品科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 兔淋巴細胞的分離及總RNA的提取 無菌采取兔外周血，肝素抗凝，在無菌條件下加入等量的PBS稀釋兔血，用兔淋巴細胞分離液分離兔PB－MC.兔淋巴細胞總RNA的提取是按照Bio Spin RNA抽提試劑盒操作說明書進行。

1.2.2 引物的設計與合成 根據GenBank上登錄的兔的白介素6序列（序列號：AF169176），設計1對引物，在引物的兩側分別加上酶切位點HindⅢ和EcoRⅠ，并在沒酶切位點上添加保護堿基。引物序列如下：

上 游： 5′－AGCAAGCTTATGAACTCCTTCACAAGCG－3′；下游：3′－GGACAGGTAACCTGTGTATTCTTAAGTAA－5′。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，預期產物片段長度約為726bp。

1.2.3 中國白兔IL－6基因RT－PCR 擴增 30μL的RT反應體系：總 RNA 9μL，10mmol/L dNTP 2μL，Oligo dT 1μL，RNAsin 0.5μL混勻，70℃4 min，再加入5×RT Buffer 4μL，Mg2＋3μL，反轉錄酶AMV 0.5μL，RNAsin 0.5μL，混勻后按如下程序進行 RT反應：30℃10min，42℃45min，95℃5min。反應產物進行PCR反應。PCR的反應體系為50μL：10×PCR Buffer 5μL，Mg2＋3μL，10mm d NTP 1μL，上游引物（30pmol/L）1μL，下游引物（30pmol/L）1μL，反轉錄產物c DNA 1 μL，TaqDNA聚合酶0.3μL，H2O 補至50μL，混勻，95℃預變性5min后按以下條件進行PCR反應：94℃30s，54℃50s，72℃60s，35個循環(huán)之后，72℃延伸10min，4℃10min后結束反應。取5μL反應產物點樣于1%瓊脂糖凝膠電泳，80V電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果并拍照。

1.2.4 中國白兔IL－6的克隆及鑒定 PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，參照Marker DL－2 000切取并回收目的條帶，按常規(guī)方法將目的片段連入載體pMD18－T，轉化JM109宿主菌，用菌落PCR、重組質粒酶切及重組質粒PCR篩選陽性質粒。將陽性質粒送往寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定。

1.2.5 序列分析 應用DNASRAR軟件，將測得序列，與GenBank上登載的世界其他5個品種的兔IL－6的核苷酸序列比較，探討中國白兔IL－6的變異規(guī)律。

2 結果

2.1 兔IL－6基因的RT－PCR擴增結果 從ConA誘導的兔外周血淋巴細胞中分離RNA后，應用RT－PCR方法擴增得到的約750bp的條帶，其大小與上下游引物涵蓋的兔IL－6核酸序列長度一致（圖1）。

2.2 兔IL－6基因的克隆與鑒定 將PCR純化產物與pMD18－T載體連接后，并轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞，在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后，用轉化子作菌落PCR鑒定，結果擴增出約750bp大小的一條帶（見圖1）。

菌落PCR陽性轉化子質粒，用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切鑒定，結果具有與目的片段大小一致的電泳帶（見圖1），表明RT－PCR產物成功地亞克隆到pMD18－T載體上。

圖1 兔IL－6RT－PCR及質粒pMD－IL－6鑒定

2.3 序列分析 經序列測定，擴增出的基因片段長726bp（見圖2），共編碼241個氨基酸，與歐洲兔（Oryctolagus cuniculus）IL－6基因（AF169176）同源性為100%，從而證明了本研究成功的克隆出了中國白兔IL－6基因。中國白兔IL－6與GenBank上登錄的白尾野兔、高山白尾野兔、加利福利亞黑尾長腿野兔和白尾長腿野兔的IL－6的基因序列同源性比較結果顯示，其種間的同源性為84.9%～91%，見圖2。進化樹分析結果表明，本研究所用的中國白兔與歐洲兔的親源性最近，與加利福利亞黑尾長腿野兔的親源性最遠。詳細情況見圖3。

遠端序列比較發(fā)現，相對于其他4種兔的IL－6基因序列，歐洲兔和中國白兔在通常的終止子的地方有特征性的突變，導致歐洲兔和中國白兔IL－6基因序列終止密碼子位于延長81bp的下游區(qū)。

3 討論

白介素6是一種多功能細胞因子，研究表明，白介素6具有疫苗分子佐劑和抗生素替代物的潛能。中國白兔IL－6基因序列，與歐洲兔IL－6的基因序列相同，相對于GenBank上登錄的其他四種野兔的IL－6基因，其同源性差異較大。由于在通常的終止子的地方有變異，下一個終止密碼子位于延長81 bp的下游區(qū)，故中國白兔IL－6基因序列3＇端的編碼區(qū)有27個氨基酸的延長。研究發(fā)現［1］，家兔和野兔這兩個譜系完全不同，家兔來自于混合家兔譜系實驗兔，野兔是通過野外鋪捉得來的，而這些野兔是一百多年前，最初的歐洲兔由于生活史的擴散，釋放到澳大利亞。兩種棉尾兔屬和兩種野兔屬，都來自北美而不是歐洲，故其IL－6基因在通常的位置出現了常見的終止子。因此，IL－6在中國白兔和歐洲兔上突變的終止子具有種的特異性，可推斷中國白兔和歐洲白兔有很近的親緣關系，可能來自相同的譜系。

兔IL－6蛋白質羧基端延伸27個氨基酸的影響不得而知。學者們提出六步格的白介素6受體復合物的模式，這個復合物由2個三聚物組成，包含IL－6，IL－6R，和gp 130單個分子［2－5］，指出IL－6分子的氨基和羧基末端位于復合物的外緣。雖然接近羧基端的幾個殘基對結合IL－6受體是決定性的［6－7］，但是一個延伸的羧基端將干擾這些相互作用是不太可能的。研究顯示［8－9］，鼠IL－6 羧基端3個和5個殘基的小延長并未影響其生物學活性。

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