骨碎補水提液對大鼠成骨細胞分泌IGF－I的影響

王 煉，韓 博，鄒宇云，王雪飛，田 丹，邢曉旭，劉鐘杰

（1.鄭州牧業工程高等專科學校 藥物工程系，河南 鄭州450011；2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193；3.山東齊魯動物保健品有限公司獸藥研究所，山東 濟南250100；4.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特010018）

骨碎補又名肉碎補、石巖姜等，是水龍骨科植物槲蕨（Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm .）的干燥根莖，味苦，性溫，歸腎、肝經，具有補腎強骨、續傷止疼等功效。本試驗采用熒光定量PCR方法觀察骨碎補水提液對體外培養的大鼠成骨細胞IGF－I基因表達的影響，探討骨碎補治療的分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 骨碎補（北京同仁堂京北藥店康大家園店）；胰蛋白酶（Sigma公司）；DMEM培養基、Ⅱ型膠原酶（Gibico公司）；總RNA提取試劑、質粒DNA提取小量提取試劑盒、E.Z.N.A.膠回收試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）。

1.2 儀器 CO2培養箱（Sanyo公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司）；旋轉蒸發儀（上海申順生物科技有限公司）；酶聯免疫檢測儀（BioRad）；Alpha Innotech紫外成像儀（北京東勝創新生物科技有限公司）。

1.3 藥液的制備與分組 取骨碎補飲片100g，常規方法制備水提液，2 500r/min離心10min，取上清，旋轉蒸發濃縮成1g/mL濃度的生藥液，調pH值至7.2～7.4，臨用前過濾除菌，用DMEM維持培養基（含4%標準胎牛血清）稀釋成不同濃度含生藥的培養液。

1.4 成骨細胞的分離培養、鑒定 取新生24h內的SD大鼠8只，用二次酶消化法獲得［1］成骨細胞并進行鑒定。試驗用細胞傳至第3代，調節至1×106個/mL的密度接種于6孔培養板，每孔3mL。待細胞24h完全貼壁后，各試驗組更換為維持培養基饑餓24h，之后更換成不同濃度的骨碎補水提液，對照組更換為DMEM維持培養液。每組設3個重復。繼續培養24h、48h、72h，每孔用1mL TRIzol收集細胞。

1.5 RT－PCR擴增IGF－I基因 用 TRIzol法提取細胞總RNA于2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測其完整性。逆轉錄合成cDNA。取2μL cDNA進行PCR擴增，用Primer 5.0設計引物，IGF－I的5′端序列為TTC AAC AAG CCC ACA GG，3′端序列為 AGC GGA GCA CAG TAC ATC，擴增長度為119bp；βactin 5′端序列為TTG TCC CTG TAT GCC TCT G，3′端序列為ATG TCA CGC ACG ATT TCC，擴增長度為218bp。反應條件為：94℃，2min，94℃，30s，56.5℃（β－actin 58.5℃）30s，72℃ 30s，40個循環，最后68℃自動延伸30s，取3～5μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL EB）電泳檢測分析，其余產物保存于－20℃。

1.6 重組質粒的制備及鑒定 用E.Z.N.A.膠回收試劑盒對PCR產物進行純化回收。回收產物與PEASY－T3克隆載體連接，轉化到DH－5α感受態細胞中，將轉化細胞接種于涂布了IPTG和X－gal的培養基上，14h后挑選陽性克隆菌落，放入含有6 mL LB液體培養基的試管中，振蕩培養8～10h，取5μL菌液20倍稀釋，做PCR擴增（反應體系同前），并取PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析結果。采用SP6和T7測序引物，對陽性菌液進行測序。取陽性菌液1～1.5mL提取質粒。用滅菌三蒸水將重組質粒稀釋20倍，取2μL作為模板，進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果。將克隆成功的重組質粒母液，取5μL稀釋100倍，用分光光度計測OD260值/OD280值，檢測質粒純度。

1.7 實時熒光定量PCR標準曲線的構建 用PCR和測序鑒定的β－actin，IGF－I陽性質粒分別按照10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10（體積分數）稀釋作為模板，按順序加入下列試劑SYBR Green 9μL；上下游引物0.25μL（20μmol/μL）；模板2μL；滅菌三蒸水8.5μL。反應條件同前72℃延伸結束后升高到95℃，開始溶解曲線分析。反應結束自動生成標準曲線。

1.8 檢測不同處理的大鼠成骨細胞中β－actin，IGF－I基因的表達 以不同處理的成骨細胞cDNA作模板，用熒光定量PCR對β－actin，IGF－I基因進行檢測，通過標準曲線計算得出β－actin，IGF－I的表達水平。

1.9 統計學處理 所有數據用平均數±標準差表示。采用SPSS 12.0軟件對數據進行統計學處理，單因素方差分析作組間差異性比較。

2 結果

2.1 成骨細胞的分離、培養和鑒定 成骨細胞培養24h后，貼壁展開，形態呈三角、多角或紡錘形，細胞核圓形或卵圓形，有1～3個核仁，胞質豐富，突起明顯。隨培養時間延長，細胞胞突相互連接，成匯合狀，繼續培養細胞重疊生長，基質堆積，細胞結節形成，茜素紅染色陽性，鈣化結節邊界清晰，呈正紅色。所培養的細胞呈現典型的成骨細胞特征，為所需細胞。

2.2 RT－PCR擴增結果 通過RT－PCR擴增得到β－actin和IGF－I的擴增產物，經瓊脂糖凝膠電泳檢測得知，長度約為218bp和119bp，與預期長度相符，表明擴增產物為目的片段。純化回收后電泳檢測表明回收成功。

2.3 重組質粒的提取及鑒定 通過對陽性菌液的測序，得到β－actin、IGF－I擴增產物的核苷酸序列與原始基因序列的同源性均為100%，證明所制備的質粒含有目的基因，序列可靠。β－actin和IGF－I質粒的OD260值/OD280值分別為1.891和1.829（一般認為比值為1.7～1.9，表明質粒質量較好），表明質粒純度較高，可用于構建標準曲線。

2.4 β－actin和IGF－I熒光定量標準曲線的建立 βactin和IGF－I標準曲線的相關系數γ2在0.995～0.999之間（γ2＞0.96被認為擬合滿意），Tm 值穩定，說明擴增效率一致，且產物的特異性良好。

2.5 溶解曲線分析 溶解曲線結果顯示，隨著溫度的升高，與雙鏈結合的SYBR GreenⅠ釋放，熒光信號也隨之平滑下降。熒光強度變化的拐點（熔點，Tm）處清晰地看到了一個單一的峰，這個峰對應著擴增產物的溶解溫度，表明擴增產物為目的產物。溶解曲線中未出現明顯雜峰，也未出現主峰的異常增寬，表明實時熒光定量PCR反應特異性良好。

2.6 骨碎補水提液對大鼠成骨細胞胰島素樣生長因子（IGF－I）表達的影響 由表1可以看出，作用24h后，各骨碎補水提液組成骨細胞IGF－I表達量均增加，與對照組相比，1×10－2mg/mL、1×10－3mg/mL、1×10－4mg/mL和1×10－5mg/mL組差異極顯著（P＜0.01），1×10－1mg/mL 組差異顯著（P＜0.05）。作用48h后，與對照組相比，1×10－3mg/mL、1×10－4mg/mL和1×10－5mg/mL組極顯著促進IGF－I基因表達（P＜0.01），1×10－2mg/mL組差異顯著（P＜0.05）。作用72h后，各骨碎補水提液組成骨細胞IGF－I表達量均降低。

表1 不同濃度肉骨碎補水提液對大鼠成骨細胞IGF－I表達的影響 （n＝6）

3 討論

IGFs是一種多功能的細胞增殖調控因子，對骨形成和骨吸收都有重要作用，近年來IGFs作為成骨細胞的影響指標，被廣泛應用于各種藥物作用成骨細胞的研究。早期研究發現，IGFs可以促進成骨細胞增殖和分化，并且調節成骨細胞I型膠原的表達。

IGF系統主要包括兩種多肽：IGF－I和IGF－Ⅱ。IGF－I對成骨細胞的作用較IGF－Ⅱ強，故本試驗選擇了IGF－I作為觀察指標。IGF－I可明顯促進正常大鼠骨組細胞的增殖和分化，增強ALP的活性和骨的礦化［2］。IGF在成骨細胞培養中均可刺激成骨細胞的增殖和I型膠原的生成，且呈劑量相關性，同時IGF還可刺激堿性磷酸酶活性以及骨鈣素的產生。IGF還能介導全身性激素對成骨細胞增殖和分化的作用。研究表明，成骨細胞原癌基因c－fos可能在誘導成骨細胞增殖中起重要作用，離體試驗顯示，IGF－I能促進鼠成骨細胞原癌基因c－fos的表達［3］。IGF－I還可以抑制體外培養成骨細胞凋亡［4］。也有學者［5］研究發現，IGF－I抑制細胞凋亡，降低 ALP的活性，并且IGF－I還能抑制腫瘤壞死因子（TNF－α）促進細胞凋亡的作用。

本實驗室已經證實一定濃度的骨碎補水提液具有促進體外培養的大鼠成骨細胞增殖和分化的作用［6］。本試驗結果顯示，與對照組相比，在作用24h、48h后，各濃度組都能促進IGF－I基因表達，促進作用隨藥物濃度降低而增強。作用72h后，各濃度組均抑制IGF－I基因表達。綜上所述，骨碎補水提液在成骨細胞早期很可能通過顯著促進成骨細胞IGF－I表達來發揮它們對成骨細胞的促增殖作用。

［1］ 吳培福，鐘代彬，曲偉杰，等.小鼠成骨細胞改良酶的消化分離培養［J］.甘肅農業大學學報，2004，39（5）：512－515.

［2］ Sakata T，Halloran B P，Elalieh H Z，etal.Skeletal unloading induces resistance to insulin－like growth factorΙon bone formation［J］.Bone，2003，32：669－680.

［3］ Floria Lupu，Joseph D，Terwilliger，etal.Roles of Growth Hormone and Insulin－like Growth FactorⅠin Mouse Postnatal Growth［J］.Developmental Biology，2001（229）：141－162.

［4］ 馬艷芬，彭綿.IGF－I和胰島素對成骨細胞功能影響的研究進展［J］.現代臨床醫學生物工程學雜志，2003，9（6）：529.

［5］ Farley J R，Stilt－Coffing B.Apoptosis may determine the release of skeletal alkaline phosphatase activity from human osteoblast－line cells［J］.Calcif Tissue Int，2001，68：43－52.

［6］ 范婧蓉，韓博，李禹濤，等.骨碎補水提液對大鼠成骨細胞的影響［J］.中國獸醫雜志，2009，45（2）：13－15.