一種基于16SrRNA基因檢測豬嗜血支原體PCR方法的建立

文輝強，劉永剛，石文達，武嘉男，姜成剛，張交兒，蔡雪輝

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室/動物疫病診斷及技術服務中心，黑龍江 哈爾濱150001）

豬嗜血支原體病是由豬嗜血支原體寄生在人或多種哺乳動物的紅細胞表面、血漿和骨髓中的一種人獸共患病。Splitter于1950年在《Science》雜志上將該病原列為附紅細胞體屬［1］。2002年，Neimark等根據其16SrRNA序列發現原附紅細胞體與支原體較為接近，正式將該病原更名為豬嗜血支原體（Mycoplasma suis）［2－3］。本試驗根據豬嗜血支原體16SrRNA基因序列，設計合成出特異性引物，建立了豬嗜血支原體PCR診斷方法，并初步應用于臨床診斷。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 AxyPrepTMBlood Genomic DNA試劑盒、AxyPrepTMBacterial Genomic DNA試劑盒、AxyPrepTMPlasmid Blood Genomic DNA試劑盒、AxyPrepTMDNA gel Extration DNA試劑盒、pMD18－T Vector、X－Gal、IPTG、TaqDNA 聚合酶均為寶生物工程（大連）有限公司產品；E.coliDH5α菌株為北京全式金生物技術有限公司產品。

1.2 豬嗜血支原體基因組提取 從臨床癥狀疑似病例中無菌采集EDTA抗凝血，用AxyPrepTMBlood Genomic DNA Miniprep kit提取M.suis基因組DNA。

1.3 引物設計與合成 根據GenBank上發表的豬嗜血支原體16SrRNA基因序列（ID：U88565），Oligo 6.0設計特異引物：FP：5′－AAGGAAGCGTAGGCTGAAGT－3′； RP：5′－TTGGTAAGGTTTTGCGTGTA－3′。引物由北京永紅英俊科技發展有限公司合成，擴增的目的片段為411bp。

1.4 PCR反應體系及反應程序 對樣本DNA進行PCR擴增。50μL體系：DNATaq酶1.5U，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，模板2μL，引物各0.5μL，加滅菌蒸餾水至50μL。反應程序：預變性95℃5min，變性94℃1min，退火56℃1min，延伸72℃1min，35個循環；終末延伸72℃10min。

1.5 克隆與序列測定 將擴增產物按照AxyPrepTMDNA gel Extration進行回收純化，回收片段進行載體與目的片段連接，按照文獻［4］上方法轉化E.coliDH5α，在X－gal/IPTG、LB培養基上進行篩選，挑選白色菌落37℃振搖培養，擴增菌液進行質粒提取和PCR鑒定，取菌液2mL送北京永紅英俊科技發展有陰公司測序。利用NCBI－BLAST進行同源比對。

1.6 特異性試驗 按 AxyPrepTMBacterial Genomic DNA提取豬肺炎支原體、大腸桿菌、沙門菌、葡萄球菌的基因組DNA（以上病原菌由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物疫病診斷中心提供）。用紫外分光光度計檢測提取后DNA含量，以確認模板中含有各病原體的基因組DNA。

1.7 敏感性試驗 提取DNA，測定其OD260值，進行10倍稀釋后進行PCR擴增，從而確定該方法的敏感性。

1.8 臨床樣本的檢測 從哈爾濱地區采集疑似豬嗜血支原體血液樣本30份進行檢測，并對陰性樣本進行重復檢測。

1.9 重復性試驗與符合率 就以上1.6、1.7與1.8分別在3個不同時間對特異性試驗、敏感性試驗與臨床樣品的重復性檢測驗證與符合率。

2 結果

2.1 目的片段PCR擴增的結果 以M.suis的16SrRNA基因設計的特異性引物進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約411bp出可見相應條帶，與理論大小相符，陰性對照沒有條帶出現（見圖1）。

2.2 質粒PCR鑒定與序列分析 將PCR產物克隆到pMD18－T載體中，經轉化、藍白斑篩選、擴大培養、質粒DNA提取后，以質粒為模板進行PCR檢測。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，證實得到相應的目的條帶。測序結果顯示，目的片段為411bp（見圖2和圖3），經NCBI－BLAST搜索同源性分析表明，該序列與參考序列（U88565）對應大小序列同源性為97.57%。

2.3 特異性試驗 電泳結果顯示，只有M.suis基因組能擴增出約410bp的片段，而其余對照基因組DNA均無擴增條帶出現（見圖4）。

2.4 敏感性試驗 經紫外分光光度計測定，血液基因組DNA OD260nm值為750ng/μL，連續10倍稀釋后進行PCR擴增，結果表明，該體系檢測M.suis基因組DNA的最大稀釋倍數為1×109，能檢測到的最高敏感度約為0.75fg/μL，約1 000copies/μL（見圖5）。

2.5 臨床樣品的檢測 從黑龍江哈爾濱地區不同豬場采集疑似豬嗜血支原體血液樣本30份，進行PCR檢測，結果有3份呈陽性，其余均為陰性。

圖3 重組質粒DNA測序結果 （411bp）

2.6 重復性試驗與符合率 通過分別在3個不同時間對特異性試驗、敏感性試驗與臨床樣品的重復性檢測驗證結果證明，特異性試驗、敏感性試驗與臨床樣品的符合率均為100%。

3 討論

迄今為止，尚無豬嗜血支原體體外連續培養方法［5］，從而對M.suis診斷方法研究有一定的阻礙作用。因此，臨床上豬嗜血支原體病的診斷仍然借助于鮮血壓片、吉姆薩或瑞氏染色法，但這類形態學觀察的局限性在于低特異性和低敏感性［6］。相對而言，吖啶橙染色方法比上述方法有較高的特異性和敏感性［7］。隨著分子生物學的不斷發展，依據16S rRNA基因或M.suis特異性基因組片段的PCR檢測成為鑒定各種動物源嗜血支原體最有效的方法［3，8－9］。而且PCR診斷對M.suis急性感染病例或長期慢性感染病例均具有很高的特異性和敏感性。本試驗根據已成功分離并提取的M.suis基因組DNA，根據GenBank中登錄的16SrRNA基因序列（ID：U88565）所涉及的特異性引物，經PCR擴增約410bp的基因片段，并成功克隆該片段，為以后了解其流行病學及致病機理有著重要意義。本實驗室進行M.suis人工感染豬，重復試驗結果表明，感染后24h即可檢測出M.suis，這與Gwaltney報道相一致［3，8］。

2008年馮會權等基于 Hoelzle報道［10］的M.suis特異性基因組片段設計引物并對疑似感染豬血樣進行PCR擴增，并且檢測血液基因組DNA的最低檢測量為 0.65fg/μL［11］。本試驗中基于 16S rRNA基因序列所設計的特異性引物，證實該方法具有較高特異性和敏感性，檢測血液基因組DNA的最低檢測量為0.75fg/μL，與馮會權等報道結果為同一數量級。且該方法經重復試驗后結果具有良好一致性，提示該PCR方法較為穩定。本試驗建立的PCR診斷方法具有較好的特異性、敏感性，是一種有效的確診手段，可用于豬嗜血支原體病的流行病學調查、診斷及療效監測等。

［1］ Splitter E J.Eperythrozoonsuisn spEperythrozoonparvumnsp 2new blood parasites of swine［J］.Science，1950，111（2889）：513－514.

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［11］馮會權，蘇玉虹，蘇榮健，等.豬附紅細胞體特異性基因的克隆和PCR診斷方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2008，30（5）：372－375.