腹瀉犢牛大腸桿菌血清型抗菌藥物耐藥性耐藥基因鑒定及脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型

張 陸，蔣 月，盛鵬飛，張秀英

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；2.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州121000）

目前大腸桿菌耐藥性問題是全球關(guān)注的熱點(diǎn)，監(jiān)測(cè)動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性具有重要的公共衛(wèi)生意義［1］。近年來關(guān)于動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性的報(bào)道很多，但主要集中在豬、雞源大腸桿菌，牛源大腸桿菌的報(bào)道相對(duì)較少。本試驗(yàn)側(cè)重于腸道來源的致病性大腸桿菌，檢測(cè)了2011年分離自哈爾濱周邊地區(qū)的犢牛腹瀉致病性大腸桿菌的血清型、基因分型和對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，掌握該地區(qū)致病性大腸桿菌的流行現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 主要材料 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂），購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；12種藥敏紙片和大腸桿菌生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司合成；rTaq酶、DL－2 000DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；藥敏質(zhì)控菌大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 致病性大腸桿菌O血清群鑒定 在哈爾濱周邊地區(qū)13個(gè)養(yǎng)牛場(chǎng)共采集腹瀉犢牛肛拭子263份，大腸桿菌的分離鑒定及菌株的致病性鑒定參照文獻(xiàn)［2］。將鑒定出的致病性菌株郵寄至中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所完成O血清型鑒定。

1.3 藥敏試驗(yàn) 采用 KB法，依據(jù)CLSI（2007）標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試及判定各菌株對(duì)阿莫西林/棒酸（AMX/CA）、頭孢噻呋納（CTF）、鏈霉素（STR）、慶大霉素（GEN）、新霉素（NEO）、四環(huán)素（TET）、多西環(huán)素（DOX）、氟苯尼考（FLR）、恩諾沙星（EN）、諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP）、復(fù)方新諾明（TSM）的敏感度。

1.4 耐藥基因的PCR檢測(cè) 采用PCR方法檢測(cè)所有致病性大腸桿菌中的：超廣譜β－內(nèi)酰胺酶基因blaSHV、blaCTX－M、blaTEM、blaOXA；氨基糖苷?；D(zhuǎn)移酶基因aadA1、aac（3）－Ⅱ；四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB，氟苯尼考耐藥基因floR。PCR擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)［3］。設(shè)ATCC25922為陰性對(duì)照。

1.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） 利用PFGE檢測(cè)上述致病性樣本之間的親緣關(guān)系。隨機(jī)選擇了來自不同地區(qū)的16株耐藥表型相同（AMC－STR－TETSXT－DOX）的菌株進(jìn)行PFGE分析，XbaI消化處理菌株染色體DNA，具體方法參照文獻(xiàn)［4］，電泳條件為120℃，脈沖切換時(shí)間為2.2s～54.0s，電泳時(shí)間19h，電壓6V，溫度14℃，結(jié)果采用BioNumerics 4.0軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 致病性大腸桿菌的分離鑒定結(jié)果 共采集肛拭子263份，鑒定出大腸桿菌187株，將187株大腸桿菌培養(yǎng)物接種小鼠后，72h內(nèi)26株導(dǎo)致小鼠死亡，因此致病性大腸桿菌為26株。

2.2 血清型鑒定結(jié)果 26株分離細(xì)菌全部被鑒定出O血清型，其中O2610株、O785株、O154株、O863株、O82株、O91株、O201株，見表1。

表1 26株致病性大腸桿菌O血清型分布、多重耐藥表型及攜帶耐藥基因類型統(tǒng)計(jì)

2.3 大腸桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果 26株致病性大腸桿菌全部為耐藥菌，其中對(duì)阿莫西林－棒酸、鏈霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明的耐藥率達(dá)到了100%，對(duì)多西環(huán)素的耐藥率為96.2%，對(duì)頭孢噻呋、氟苯尼考、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的耐藥率分別為19.2%、19.2%、11.5%、7.7%和3.8%，而對(duì)慶大霉素和新霉素全部敏感。

2.4 致病性大腸桿菌的耐藥表型和耐藥基因型全部26株分離菌的多重耐藥率達(dá)到了100%，其中最少為4耐，最多為9耐，共有8種耐藥表型，優(yōu)勢(shì)表型是 AMX－STR－TET－TSM－DOX。而耐藥基因blaTEM、blaCTX－M、aadA1、aac（3）－II、tetA、tetB、floR的檢出率分別為 84.6%、19.2%、73.3%、11.5%、69.2%、38.5%、19.2%。具體耐藥表型及耐藥基因攜帶情況見表1。

2.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果 通過電泳圖譜的聚類分析結(jié)果（圖1）可見，部分不同地區(qū)來源的分離株具有相同的基因譜型，例如D2、H6、Z16與Z20，S11、S12與A3，S8與H9。這說明在哈爾濱周邊不同地區(qū)之間存在著相同致病性菌株的克隆傳播。而且將此結(jié)果與菌株血清型測(cè)定結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)PFGE圖譜一致的菌株血清型均相同，但血清型相同的大腸桿菌PFGE不一定相同。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)共鑒定出26株致病性大腸桿菌，其主要流行的血清型為 O26（38.5%）、O78（19.2%）和 O15（15.4%），這與文獻(xiàn)報(bào)道［5］牛致病性大腸桿菌的主要血清型為 O8、O9、O15、O20、O26、O35、O78、O101、O115、O117、O137比較符合。通過PFGE圖譜可得出哈爾濱地區(qū)存在著相同致病株的克隆傳播。而且將PFGE結(jié)果與菌株的血清型對(duì)比，可發(fā)現(xiàn)PFGE圖譜一致的菌株血清型均相同，但血清型相同的大腸桿菌PFGE不一定相同，這與中國獸藥監(jiān)察所張媛等［6］得出的結(jié)論“PFGE相似率在85%以上的致病性大腸桿菌血清型均相同，但血清型相同的大腸桿菌PFGE不一定相同”相似。

26株致病性大腸桿菌對(duì)12種藥物的耐藥性呈現(xiàn)兩極分化，對(duì)阿莫西林/棒酸、鏈霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明的耐藥率極高達(dá)到了100%，對(duì)多西環(huán)素的耐藥率也達(dá)到了96.15%，此結(jié)果高于國內(nèi)相關(guān)報(bào)道［1，7］。而相反，本試驗(yàn)對(duì)慶大霉素、新霉素的耐藥率為0，這個(gè)數(shù)據(jù)低于國內(nèi)所有相關(guān)報(bào)道。上述情況表明，不同地區(qū)的分離菌的耐藥性有較大差異，說明不同地區(qū)用藥情況和特點(diǎn)不同。

在26株致病性大腸桿菌中，7種耐藥基因檢出率基本上與報(bào)道［8］數(shù)據(jù)和菌株的耐藥表型相一致。特殊情況在于介導(dǎo)慶大霉素耐藥的aac（3）－Ⅱ基因，特點(diǎn)是除耐藥株外，在敏感株中也檢出該基因，分析原因可能是由于環(huán)境選擇壓力下降，導(dǎo)致基因不表達(dá)或表達(dá)不完全［9］，有待進(jìn)一步研究。

［1］ 賴婧，劉洋，汪宇，等.800株不同動(dòng)物源大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)［J］.中國獸醫(yī)雜志，2011，47（4）：12－14.

［2］ 蘇海峰，蔣月，徐國鋒，等.哈爾濱周邊地區(qū)豬源致病性大腸桿菌耐藥性分析［J］.中國獸醫(yī)雜志，2012，48（6）：46－49.

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［8］ 趙紅霞.奶牛子宮內(nèi)膜炎致病大腸桿菌的分離、鑒定及耐藥性研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2008，31－42.

［9］ 顧兵，童明慶，趙文君，等.銅綠假單胞菌多重耐藥機(jī)制研究［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（12）：1097－1102.