水解酶技術在食品工業中的應用研究進展*

張蓓，段小明，馮敘橋，蔡茜彤，范林林，李萌萌

(渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)

隨著生物技術的不斷發展與進步，生物酶技術在食品工業中的應用也越來越受到重視。酶技術是指在一定的生物反應器內，利用酶的催化作用進行物質轉化的技術，是酶科學在生產實踐中的應用;酶的應用范圍已經遍及工業、醫藥、農業、化學分析、環境保護和生命科學等各個方面［1］。與化學法等傳統食品加工方法相比，酶技術不會產生有毒有害物質，可以為食品加工提供更健康、環保、安全有效的解決方案［2］。為了避免酶源命名的混亂以及滿足為大量新出現酶命名的需要，國際上采用一個通用的酶命名和分類系統，此系統根據酶所催化的反應類型，將所有的酶分為氧化還原酶(oxido－reductase)、轉移酶(transferase)、水解酶(hydrolase)、裂合酶(lyase)、異構酶(isomerase)、連接酶(ligase)等 6 大類［3］。隨著酶技術的發展，水解酶在食品工業中得到了廣泛的應用。文中分別介紹了水解酶技術在制備食品原輔料、改善食品品質及食品保鮮中的應用及研究進展，分析了存在的問題并對發展趨勢進行了展望，旨在促進相關研究以推動水解酶技術在食品工業中的應用和發展。

1 水解酶技術在食品工業中的研究現狀

1.1 制備食品原輔料

水解酶能夠催化底物的加水分解反應，大部分屬于細胞外酶，在生物體內分布最廣，數量較多;水解酶可水解糖苷鍵、肽鍵、酯鍵、醚鍵、酸苷鍵及其他C—N鍵，常見的有糖酶(carbohydrase)、蛋白酶(protease)、脂肪酶(lipase)以及核酸酶(nuclease)［3］。糖酶、蛋白酶和脂肪酶在生產以及改性糖類、脂類、乳制品、水產品、飲料和藥食同源食品等方面具有非常廣泛的應用。由表1可知，不同的酶在制備食品原輔料時具有不同的作用條件，如酶解溫度、酶解時間、酶用量以及pH等，對此，許多研究者選取某種研究方法如單因素試驗、正交試驗和響應面法等來篩選最適宜的條件，為食品原輔料的酶法工業化生產提供一定的指導。

1.1.1 糖酶

糖酶主要用于制備功能性低聚糖(表1)，這是因為合成功能性低聚糖的方法一共有5種:直接從天然原料中提取、利用酶催化的糖基轉移反應進行合成、天然多糖酸水解、化學合成以及天然多糖酶水解［4］。在實際應用中，從天然原料直接提取功能性低聚糖幾乎是不可能的，因為它們濃度極低，而且無色、不帶電荷，只能使用先進的分離技術進行提取，但成本昂貴，故限制了此法的應用［5］;多糖酸水解法獲得的水解物中糖類組分極其復雜，因此不易控制并獲得具有特定結構的功能性低聚糖;對于化學合成法而言，它需要復雜而冗長的保護和去保護步驟才能達到選擇性的控制合成特定低聚糖的目的，而且得率低較低，很難實現低聚糖的規模性生產［6］。而利用酶技術生產功能性低聚糖，無論是酶法水解還是酶法合成，都能在不需要基團保護的溫和條件下進行具有立體和區域選擇性的反應［6］。從食品工業角度來看，作為一種大量使用的功能性原料，低聚糖的生產成本是一個不可忽視的因素，因此酶法生產功能性低聚糖是一種較理想的方法。

此外，糖酶在啤酒的制備過程中也具有一定的作用(表1)。在啤酒生產過程中，高濃度釀造工藝與傳統釀造方法相比，可以在不增加糖化和發酵設備的基礎上大幅度地提高啤酒的產量［7］，而通過在麥汁煮沸結束前加入部分麥芽糖漿的方法制備高濃麥汁，可以簡化麥汁過濾工藝，且不影響麥汁質量［8］。真菌淀粉酶可以從淀粉內部切割α－1，4糖苷鍵并繞過α－1，6糖苷鍵繼續作用，所以最終糖化液中麥芽糖含量可達50%左右而不會有大分子極限糊精殘留［9］。

1.1.2 蛋白酶

蛋白酶主要用于水產品深加工(表1)。在海洋捕撈中，低值魚和小雜魚一直占有較大的比例，隨著人們生活水平的提高，二者的直接食用價值越來越低，應用水解酶技術生產濃縮水解魚蛋白則是水產品綜合利用的一條新途徑［1］。水解動物蛋白可以作為食品添加劑而用于肉制品、乳制品、保健食品、果奶飲料以及味精中，以達到增強風味及穩定性，提高制品營養價值，延長保質期等目的［10］。除此之外，蛋白酶也可用于貝類產品中制備海鮮調味料，用于蝦中制備甲殼素，所以蛋白酶有助于改變水產品加工工業及改進國內現有加工方法，促進水解酶技術在水產品工業中的應用。

1.1.3 脂肪酶

由表1可知，用于制備脂類物質的脂肪酶主要是固定化脂肪酶(immobilized lipase)，脂肪酶的固定化方法與其它酶大致相同，可以分為包埋法、吸附法、共價結合法以及交聯法等;經過固定化的酶，穩定性增加，易于從反應系統中分離且反應條件易于控制，便于運輸和貯存，能反復連續使用，有利于自動化生產［11］。脂肪酶使許多脂類物質的制備成為可能，如1，3－特異脂肪酶(1，3－specific lipase)具有獨特的位點識別功能，可以催化棕櫚油與硬脂酸發生反應以提高產物的性能，從而得到與可可脂有相似性質的脂肪［12］;脂肪酶可以通過酶法酯交換技術將各種植物油用制成人造奶油基料油，不僅能夠改善油脂的功能特性，而且可以根據不同人群的需要，在人造奶油中引入特殊脂肪酸，使人造奶油更加營養、健康［13］。

表1 水解酶在食品生產中的若干應用實例Table 1 Several examples of hydrolase application in producing food

1.2 改善食品品質

通過在食品加工過程中添加一些種類的酶，可以使產品的顏色、風味、質地以及穩定性得到優化，從而改善食品的品質;另外，可以采用酶處理一些含有難消化成分的食品，從而改善這類食品的營養和消化利用性能［10］。從目前報道的研究結果來分析，研究人員主要采用單因素及正交試驗通過不同的評價指標來優化食品品質改良工藝(表2)。

用于改善食品品質的酶主要有糖酶、蛋白酶以及少量的脂肪酶和其他類酶(表2)。其中糖酶和脂肪酶均可用于焙烤制品中，通過改善食品的流變特性等性質來提高面團的焙烤性能，但二者作用機理及效果不同。用于改善面團品質的糖酶主要是淀粉酶，其中葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)能將淀粉全部水解為葡萄糖，降低面團發酵時間，改善面包顏色、組織結構與柔軟度;麥芽糖淀粉酶(maltose amylase)可水解直鏈淀粉和支鏈淀粉生成α－麥芽糖和少量糊精，具有抗老化、增加面包柔軟度和延長貨架期的作用;由于細菌淀粉酶(bacterial amylase)可以在焙烤時仍保持較高的酶活，而產生過量的可溶性糊精，致使最終產品發粘，因此要嚴格控制添加量;與細菌淀粉酶相反，真菌淀粉酶(fungal amylase)的熱穩定性較差，大部分在淀粉開始糊化前已失活，故對淀粉的作用率較低［29］。面團中的脂類物質受脂肪酶作用后，能夠均勻地包裹住吸水脹大的淀粉顆粒，防止烘烤過程中水分散失;除此之外，因谷蛋白決定面團彈性和粘合性，谷蛋白多時，面團筋力就強，脂肪酶能夠通過與甘油三酯作用而阻止其與谷蛋白結合，從而起到增筋作用;另外，甘油三脂的水解有利于磷脂的形成，使面筋網絡增強;脂肪酶不僅能夠提高面團筋力，改善面粉蛋白質流變學特性，還增強面團強度和耐攪拌性，及面包入爐急脹能力，使面包組織細膩均勻、面包芯更柔軟、延緩老化［30］。

另外，糖酶和蛋白酶常被用于啤酒生產工藝中，用于改善麥汁的黏度和濁度，提高啤酒的非生物穩定性:糖酶中的β－葡聚糖酶可作用于β－葡聚糖的β－1，3和1，4糖苷鍵，使β－葡聚糖分解成還原糖和寡糖;在糖化階段加入β－葡聚糖酶可以有效的預防β－葡聚糖渾濁的產生［31］。添加蛋白酶可以改變啤酒中蛋白質的電性或將其分解，使之不與多酚物質結合，能有效地提高啤酒的非生物穩定性，常見的蛋白酶有木瓜蛋白酶(papain)和生姜蛋白酶(ginger protease)。生姜蛋白酶是一種硫醇蛋白酶，它可以使啤酒中的大分子蛋白質和蛋白類色素等物質分解為具有較高穩定性且能與考馬斯亮藍呈色的多肽和氨基酸等物質，從而提高啤酒的澄清度［32］。木瓜蛋白酶是從番木瓜果汁中提取出來的一種純天然的蛋白酶，具有活性強、穩定性好、耐高溫、對pH和金屬離子濃度變化不明顯等特點［33］。將木瓜蛋白酶用于冷凍貯藏的啤酒中，可水解啤酒中的蛋白質和一些已經形成的復合物，在生成大量的多肽或氨基酸的同時，保證啤酒澄清度，改善啤酒口感，提高啤酒營養價值［32］。

表2 水解酶在改善食品品質中的若干應用實例Table 2 Several examples of hydrolase application in improving food quality

1.3 水解酶技術在食品保鮮中的應用

現有的食品保鮮技術主要有冷藏、氣調保藏和輻射保藏等方法，但這些方法設備昂貴、成本高;而利用自然冷資源進行保鮮雖然可以有效地降低成本，但受到地理位置的限制，尚未得到大面積的應用［46］;利用化學保鮮劑對食品進行保鮮會造成較多的化學物質殘留，因此尋找一種既經濟又安全的保鮮方法是研究者們面臨的一大課題。酶制劑本身無毒、無味、無臭［47］，將其作為食品添加劑應用于食品保鮮中，可以大大的提高食品的安全性。應用于食品保鮮中的水解酶主要是溶菌酶以及部分的異淀粉酶和脂肪酶。

1.3.1 溶菌酶在食品保鮮中的應用

溶菌酶(EC3.2.1.17)是一種食品級抑菌酶，在控制食品腐敗菌方面具有的獨特的作用，對革蘭氏陽性菌作用最為明顯;溶菌酶具有廣泛的的pH和溫度耐受范圍，因此可以作為一種安全的食品防腐劑應用于食品保鮮中［48］。從目前報道的研究結果來看，溶菌酶主要用于肉制品、水產品以及乳制品的食品保鮮中，研究人員采用的研究方法主要是單因素及正交試驗，并通過感官特性、微生物指標、揮發性鹽基氮(TVB－N)、硫代巴比妥酸含量(TBA)以及pH等指標來優化保鮮工藝(表3)。

表3 溶菌酶在食品保鮮中的若干應用實例Table 3 Several application examples of lysozyme in food

溶菌酶是一種無毒、無害、安全性高且具有一定的保健作用的蛋白質，不僅可以延緩食物變質，還能延長食物貨架期。肉中營養物質豐富，水分活性高，是微生物繁殖的良好基質，因此將溶菌酶用于肉制品保鮮中將具有很大的應用前景［49］。由表3可知，使用溶菌酶作為保鮮劑的肉制品大致可以分為鮮肉、冷卻肉和成品及半成品肉3類，而且溶菌酶基本不單獨用于肉類制品的保鮮，這是因為雖然溶菌酶可以分解革蘭氏陽性細菌中的枯草桿菌和耐輻射微球菌等，但是對酵母菌、霉菌的作用較弱，因此復合保鮮劑的使用可以對食品腐敗菌起到較好的抑制作用，大大延長肉制品的貨架期［50］。

水產品及其制品蛋白質含量高、脂肪含量低，極易發生腐敗變質，為了確保原料的新鮮度，在水產品生產加工、貯運過程中普遍添加防腐劑，而GB 2760－2011《食品添加劑使用標準－增補》中對溶菌酶的適用范圍和用量作了相應的規定，因此將溶菌酶應用于水產品防腐保鮮具有很大的發展前景［50］。從目前報道的研究結果來分析，溶菌酶在水產品防腐保鮮中的應用主要有單一溶菌酶保鮮劑和復合溶菌酶保鮮劑兩種方式(表3)，單一保鮮劑所需材料少，制備工藝簡單，便于大型工業化生產，但這同時也限制了它保鮮性能，即抑菌譜較窄;而復合保鮮劑根據柵欄理論，將具有不同抑菌功能的保鮮劑組合，達到協同增效的目的，但制備工藝復雜。

乳品在加工、運輸和貯藏過程中，常受到氧、微生物、溫度、濕度和光線等因素的作用而導致色、香、味以及營養成分等發生變化，因此如何在乳品加工、運輸和貯藏過程中盡可能的保留其原有的品質和特性是一個至關重要的的問題［47］，而溶菌酶保鮮作為一種新型的保鮮技術正引起人們的極大關注。溶菌酶在乳制品中主要用于奶粉、液態奶以及干酪的保鮮中，用于奶粉中的溶菌酶要在噴霧干燥之后加才會發揮較好的抑菌效果，最適添加量為500 mg/L;而用于液態奶以及干酪中的溶菌酶通常與其它物質復合使用，以增加抑菌性能(表3)。

1.3.2 異淀粉酶在食品保鮮中的應用

異淀粉酶(EC3.2.1.68)能夠專一性的分解糖原及支鏈淀粉中處于支叉地位的α－1，6糖苷鍵，從而形成直鏈淀粉和寡聚糖［68］。直鏈淀粉易凝結成塊而形成結構穩定的凝膠物質，常以薄膜的形式應用于食品保鮮，這種薄膜對氧氣和油脂有良好的阻隔性，且涂布性好，適于作為產品的保護層［69］。朱香云［70］用異淀粉酶處理成膜基質淀粉，在與對照組厚度相同的條件下，拉伸強度減少80.81%，斷裂伸長率和醛基含量分別增加了1210.66%和0.442 mol/g。因此，將異淀粉酶應用于以淀粉為成膜基質的食品保鮮膜的生產是可行的。

1.3.3 脂肪酶在食品保鮮中的應用

脂肪酶(EC3.1.3.3)在動植物組織及微生物中普遍存在，是最早研究的兩類酶之一，至今已有上百年的歷史，按底物專一性可分為非專一性脂肪酶(non－specific lipase)、1，3－專一性脂肪酶(1，3－specific lipase)、脂肪酸專一性脂肪酶(fatty acid－specific lipase)三類，可催化酯化、轉酯、酯交換及對映體拆分等化學反應［71］。目前脂肪酶已經廣泛地用于制備油脂和改善面團焙烤品質等食品加工中，而在食品保鮮方面脂肪酶主要用于水產品以及焙烤制品的保鮮中。海洋中的中上層魚類，如鯖魚、鮐魚等，由于脂肪含量較高的，因此在保鮮、加工和銷售過程中極易發生腐敗變質，而脂肪酶可以對這些魚進行部分脫脂，延長魚產品的貯藏期［72］。福建師范大學研制的脫脂鰭魚片和寧波大學開發的脫脂大黃魚等，均是水解魚中的部分脂肪，從而達到延長魚類產品貯藏期的目的［73］。在生面團中加入脂肪酶可以水解部分三甘酯，達到增加單甘酯含量，延長面包保質期的作用［71］。另外，面包在貯藏過程會由于老化而導致食用品質下降，面包的老化機理極其復雜，目前主要有三種推理:淀粉重結晶、面包內水分遷移損失以及蛋白質與淀粉的相互作用［74］。張巒［74］采用一種新型重組華根霉脂肪酶(Rhizopus chinensis lipase，RCL)處理面團，通過測量面包芯硬度的變化以及面包內淀粉重結晶的程度來研究面包的老化情況，TPA和DSC實驗表明，RCL能夠顯著降低面包的老化速度，具有較好的抗老化效果。

2 水解酶技術在食品工業應用中存在的問題及解決方法探討

綜上所述，水解酶技術已經給食品工業帶來了極大的革新和進步，許多食品方面的難題都因水解酶技術的應用而得到了解決，但由于酶是由活細胞產生的具有催化能力的活性成分，因此由于各種因素的限制而使其在實際應用中存在一定的困難。

2.1 不易回收且難于實現連續化、自動化生產

自由酶反應通常在溶液中進行，反應后殘留在溶液系統中而難以實現最終產品的生化分離提純操作;另外，自由酶反應只能分批進行，難于實現連續化、自動化操作，這極大地阻礙了水解酶技術的發展與應用;而將酶固定在特定的載體上可以限制酶的運動，便于將酶從反應系統中回收及進行連續化自動化操作［75］;但由于酶要經過分離、固定化等處理，因此固定化酶也具有一些缺陷:(1)在固定化過程中，酶活力會損失，其中胞內酶在預分離過程中損失較大;(2)成本高，初期投資大;(3)應用范圍較窄，只能用于水溶性底物，特別是小分子底物，大分子底物基本無法進行反應;(4)不適用于多酶反應，部分酶還需要輔助因子協助才可以使反應有效進行;因此當開發新的固定化酶工藝時，要考慮酶的成本及穩定性、載體的價格、固定化工藝及下游工程，當采用固定化酶工藝總體效果優于化學工藝時，可以考慮使用前者［76］。

2.2 穩定性差

絕大多數酶的化學本質都是蛋白質，其最大的缺點就是不穩定，分為化學不穩定和物理不穩定兩種形式;其中化學不穩定是由于氨基酸殘基的修飾或變化引起的，物理不穩定主要涉及由酸、堿、熱及有機溶劑引起的蛋白質的二級、三級和四級結構的變化［77］。而酶經過固定化后穩定性一般均有所提高，對抑制劑和蛋白酶敏感性降低，對溫度和 pH適應范圍增大［75］。我們也可以在具有較高穩定性的物質中提取控制穩定性的基因，并通過基因工程技術開發出具有較高穩定性的酶;另外，極端酶對物理不穩定性因素也具有較高的耐受能力。

2.3 基礎研究不足

水解酶技術對操作條件要求嚴格，為使水解酶在工業化生產中發揮最大作用，必須綜合考慮酶的濃度、溫度、pH、作用時間、底物濃度等因素的影響;同時，某些物質能夠作為激活劑使酶的活性增強，某些物質能夠作為抑制劑使酶的活性降低;例如，氯化鈉為唾液淀粉酶的激活劑，硫酸銅為該酶的抑制劑;但激活劑與抑制劑并不是絕對的，某些物質在低濃度時為某種酶的激活劑，在高濃度時反而成為該酶的抑制劑，例如氯化鈉達到1/3飽和濃度時則為唾液淀粉酶的抑制劑［78］。因此，我們應加強對生產所需酶基礎理論的研究，對于開發新酶種、菌種選育、提高酶活、確立有利于降低成本的工藝條件等核心技術體系進行進一步完善。

3 水解酶在食品領域中的發展前景與趨勢

酶技術是一種源于自然界自身的技術，它在食品工業中的應用已經充分反映了21世紀食品添加劑與食品工業發展的新趨勢。隨著基因工程等新技術的發展，酶工程應用潛力有望進一步發揮［2］。

3.1 深入研究開發極端酶，擴大水解酶在食品工業中的應用范圍

在食品工業中存在著很多的極端環境，如高溫、強酸、強堿以及高滲等，普通酶的活力在這樣的環境中通常會降低甚至喪失，因此開發出能在極端環境下起生物催化作用的酶是人們一直以來需要解決的問題［79］。極端酶(extremozymes)主要來源于嗜極菌(extremophiles)，是這類微生物生存和繁衍的基礎，它能耐受食品生產過程中的一些“極端”條件，發揮一般生物酶所不具備的催化特性［72］。如嗜熱酶(thermophile enzymes)克服了中溫酶及低溫酶在反應過程中出現的不穩定現象，從而使許多化學反應在高溫下能夠高效穩定地進行［80］。極端酶的研究，極大地拓寬了人們對酶特性的認識和生物催化劑的應用范圍。但是極端酶的結構、功能與穩定機制之間的關系尚不清楚，隨著研究的深入及DNA重組技術的利用，相信極端酶的開發和應用將會出現誘人的前景。

3.2 水解酶技術與基因工程技術相結合

應用基因工程技術創造高活性的新酶源是水解酶技術發展的一個趨勢。DNA重組技術對酶工業的滲透，導致了酶工業的迅速發展:纖維素酶的基因克隆始于1970年左右，迄今為止，已經報道和公布了7000多個纖維素酶基因序列和相應的氨基酸，這其中有500多個纖維素酶的3D結構被預測［81］;通過基因工程合成的水生動物重組溶菌酶不僅能夠溶解常見的革蘭氏陽性細菌，還能夠溶解經常引起水產動物嚴重病害的革蘭氏陰性菌，因此可以將重組海參溶菌酶應用于水生動物病害的防治及提高自身的免疫力［82］。酶的體外定向進化(實驗分子進化，experimentally molecular evolution)，是通過易錯 PCR、DNA等改組方法，在酶結構和功能未知的條件下模擬自然進化過程，對酶基因進行隨機誘變、重組，最終篩選出合理的突變酶的一種方法，該技術能夠提高酶的催化能力、抗熱性以及穩定性［83］。這方面的工作值得更多的投入，與之配套的反應模型和快速檢測方法的建立是重要的環節。為了更好地利用自然界中豐富的水解酶資源，人們對水解酶的基因工程研究還在繼續。相信在不遠的將來，會有大量的水解酶基因被克隆，更先進的基因操作技術將被發明。

3.3 改進水解酶的加工技術

除水解酶種類的開發外，在酶的加工技術方面也期望有新的突破。在酶的加工反應中，為了使水解酶能夠充分發揮它的催化能力，可以采用一些新的處理方法:(1)加速固定化酶技術的研究與應用，提高固定化酶的再生活性;(2)深入研究酶制劑膠囊化技術，盡可能保持酶活性的穩定;(3)利用基因工程對受體酶DNA核苷酸序列進行重新編碼，獲取活性高、熱穩定性好、pH適用范圍廣的新酶源［84］。同時，水解酶新型反應體系及相關生物反應器的建立與研究同樣是水解酶技術面向產業化的重要課題。隨著水解酶加工技術的不斷改進與發展，水解酶在食品工業中的應用潛力將有望進一步發揮。

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