乙醇/硫酸銨雙水相體系分離純化葡萄籽總黃酮*

張喜峰，楊春慧，羅光宏

1(河西學院農業與生物技術學院，甘肅張掖，734000)2(河西學院凱源生物技術開發中心，甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅張掖，734000)

在葡萄酒加工過程中，每年產生約占葡萄加工量20%～30%的籽渣廢棄物，其中主要是葡萄皮種子和果梗等［1］。葡萄籽渣含有多酚類化合物［2］、白藜蘆醇［3］、花色素［4］、膳食纖維［5］、蛋白質［6］、黃酮［7］等多種功能性成分。黃酮類化合物有明顯的抗潰瘍、抗菌、抗炎、生物抗氧化性、抗衰老、治療心腦血管疾病等藥用保健功能，是一類具有廣泛開發前景的天然抗氧化劑［8］。

賴泉斌［9］利用水提醇沉的方法獲得了葡萄籽總黃酮，但需多次提取，操作繁瑣，周期較長。雙水相萃取技術具有操作條件溫和、處理量大，易于連續操作，傳質速度快，被廣泛應用生物化學領域。但傳統的雙水相體系有原料成本較高，高聚物回收利用困難等缺點。以無機鹽代替高聚物的普通有機物雙水相體系以其價廉、低度、體系簡單及后續處理容易等優點，適用于極性物質提取和純化，使雙水相萃取的工業化成為可能［10］。

本文采用無水乙醇和硫酸銨雙水相體系萃取葡萄酒下腳料中的葡萄籽總黃酮。通過單因素和Box-Behnken的組合試驗，考察粗提液質量分數、pH值、NaCl質量分數對葡萄籽總黃酮萃取過程中分配系數及萃取率的影響，以確定雙水相體系萃取葡萄籽總黃酮優化條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:取甘肅濱河食品工業集團葡萄酒下腳料，經挑選、清洗、曬干，得到干凈的葡萄籽。

試 劑:NaNo2、Al(NO3)3、NaOH、無 水CH3CH2OH、(NH4)2SO4、NaCl均為分析純。

1.2 儀器與設備

PL-203電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，XO-SM5O超聲波-微波反應系統(南京先歐儀器制造有限公司)，DKB-501數顯超級恒溫水浴鍋(揚州市三發電子有限公司)，DHG-9101.1電熱恒溫鼓風干燥箱(上海光譜儀器有限公司，FZ102植物試樣粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)，722型分光光度計(上海光譜儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄籽粗提液的制備

準確稱取10 g已粉碎的葡萄籽粉末，以1∶8(g∶mL)料液比加入體積分數50%乙醇中，在超聲波-微波反應系統下，超聲10 min，抽濾，收集濾液得葡萄籽總黃酮粗提液，測定粗提液中葡萄籽總黃酮的含量。

1.3.2 雙水相萃取方法

稱取一定量無水乙醇、(NH4)2SO4、粗提液、蒸餾水于小燒杯中，使雙水相體系總質量為10.00 g，充分振蕩使成相物質溶解，并調節體系pH，靜置10 min，兩相達到相分離，葡萄籽總黃酮富集于雙水相系統的上相中，測定相比R和葡萄籽總黃酮的含量［11］，并計算其分配系數K及萃取率Y，如下式:

1.3.3 黃酮含量測定

精確稱取蘆丁對照品1.0 g用體積分數50%乙醇溶解配制成黃酮濃度為1 mg/mL的乙醇溶液。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于6 個10 mL 容量瓶中，加入0.30 mL質量分數5%NaNO2溶液，靜置6 min，加入 0.30 mL10%Al(NO3)3，靜置 6 min，再加入4 mL質量分數4%NaOH溶液，靜置15 min后，用水定容至刻度。分別用分光光度計于510 nm測定吸光度A，繪制標準曲線方程:A=1.245x－0.002 4，R2=0.999 2。式中x為溶液中黃酮的質量(mg);A為吸光度值。

1.3.4 乙醇-硫酸銨雙水相體系的確定

通過改變乙醇質量分數、硫酸銨質量分數確定雙水相體系的組成。

1.3.5 影響葡萄籽黃酮萃取的因素

1.3.5.1 單因素實驗設計

在確定了雙水相體系組成后，研究黃酮粗提液質量分數、pH值、NaCl質量分數對黃酮提取率的影響。

1.3.5.2 Box-Benhnken Design實驗設計

根據單因素實驗結果，設計黃酮粗提液質量分數、pH、NaCl質量分數三因素三水平17個組合Box-Benhnken Design實驗，確定葡萄籽黃酮萃取的最佳工藝條件。

1.3.6 數據分析

單因素部試驗和中心組合試驗結果的分別采用Excel和Design-Expert 7.0在試驗設計的同時按相應方法進行，所有試驗均重復3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 無水乙醇質量分數對葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

在無水乙醇-(NH4)2SO4雙水相體系中，選擇19% 、21% 、23% 、25% 、27% 無水乙醇，(NH4)2SO4質量分數22%，粗提液質量分數為20%組成雙水相，室溫(25℃)條件下，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析，結果見圖1。

由圖1可知，在(NH4)2SO4質量分數一定的情況下，隨著無水乙醇質量分數的增加，總黃酮提取率和分配系數都增加，當無水乙醇質量分數達到23%時，總黃酮提取率和分配系數都達到最大，此后，隨著無水乙醇質量分數的增加，總黃酮提取率和分配系數都顯著下降，其主要原因可能是無水乙醇質量增加了雙水相體系的分相能力增加，黃酮在乙醇中溶解度比在水中的大，但乙醇質量分數過高時，其他有機物的溶出量也會增加，而抑制了總黃酮的浸出［12］，因此，確定最佳的無水乙醇質量分數為23%。

圖1 無水乙醇質量分數對葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.1 Effect of the ethnol concentration on Partitioning behaviour of grape seed total flavonoid

2.2(NH4)2SO4質量分數對葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

分別選取15%、17%、19%、21%、23%(NH4)2SO4，23%無水乙醇質量分數和葡萄籽總黃酮粗提液質量分數為20%分別組成雙水相體系，在室溫條件下，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析，結果見圖2。

圖2(NH4)2SO4質量分數對葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate concentrationon Partitioning behaviour of grape seeds total flavonoid

由圖2可知，隨著(NH4)2SO4質量分數的增加，分配系數和萃取率先是逐漸上升，當質量分數達到17%時呈下降趨勢?？梢?，(NH4)2SO4質量分數影響雙水相體系，可以改變各相中成相物質的組成和相比［13］，從而影響黃酮在上相中的分配，當(NH4)2SO4質量分數過高時，雙水相體系有硫酸銨沉淀析出，影響黃酮浸出［12］，導致分配系數和萃取率隨(NH4)2SO4質量分數的增加而下降。因此選擇(NH4)2SO4的最佳質量分數為17%。

2.3 粗提液質量分數對葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

在室溫下，23%無水乙醇-17%(NH4)2SO4雙水相體系中，分別加入質量分數為10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%的黃酮粗提液，在室溫條件下，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析，結果見圖3。

圖3 粗提液質量分數對葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.3 Effect of crude extract concentration on partition of grape seeds total flavonoids

粗提液加入量是雙水相萃取的一個重要參數，從成本考慮多加入一些。如圖3所示，粗提液的質量分數影響上下相的分配，當粗提液質量分數17.5%時萃取率和分配系數最大。因此，確定粗提液質量分數最佳為17.5%。

2.4 pH值對葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

將23%無水乙醇-17%(NH4)2SO4和17.5%葡萄籽總黃酮粗提液，在室溫(25℃)條件下，用HCl和NaOH調節體系 pH值，在 pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析。

圖4 pH值對葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.4 Effect of pH value on partition behaviour of grape seeds total flavonoids

如圖4所示，pH＜7時，隨著pH值增大分配系數和萃取率逐漸增大;pH=7時分配系數和萃取率達最大;當pH＞7時，分配系數和萃取率隨pH值的增大而減小。在無水乙醇-(NH4)2SO4雙水相體系中，上相電位為正，下相電位為負，當pH值較低時，黃酮的電離平衡受到影響，并吸附H+而攜帶正電荷，pH值改變了黃酮的電荷性質，黃酮開始向電位為負的下相富集，分配系數下降，但堿性過強時，會破壞黃酮母核，導致黃酮的萃取率降低［13－14］。因此選擇pH 7。

2.5 NaCl質量分數對葡萄籽總黃酮萃取效果的影響

以質量分數為23%的無水乙醇和質量分數為17%(NH4)2SO4作為雙水相體系，在 pH 7、室溫(25℃)條件下，分別加入 0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3.0%NaCl，攪拌至兩相充分混勻，對上下相溶液進行分析。

由圖5可知，隨著NaCl質量分數增加，分配系數變化基本與萃取率的變化同步。無機鹽的加入可以改變兩相間的電位差和相比，縮短了分相時間，提高了相分離速度，從而增加了黃酮在上相的分配，但鹽質量分數增加到一定程度后，萃取相的極性增強，使黃酮的溶解度下降導致出現鹽析現象，使分配系數降低［15］。實驗結果可知，NaCl添加量為2.5%時，萃取率最高。因此，選擇NaCl質量分數選擇2.5%左右為宜。

圖5 NaCl質量分數對葡萄籽總黃酮分配行為的影響Fig.5 Effects of NaCl concentration on partitioning behaviour of grape seed total flavonoids

2.6 響應面結果分析

根據以上單因素的試驗結果，采用響應面方法進一步優化試驗條件。據Box-Behnken的組合設計原理，以萃取率為響應值，在無水乙醇-(NH4)2SO4體系基礎上，對粗提液質量分數(A)、pH值(B)、NaCl質量分數(C)設計了3因素3水平的17組試驗，其中5組中心點重復試驗。選取的試驗因素和水平見表1，試驗方案和結果見表2。

表1 Box-Behnken設計因素水平表Table 1 Factors and levels ofBox-Behnken Design

2.6.1 Box-Benhnken Design試驗數據分析

表2 Box-Behnken設計方案與結果Table 2 Arrangement and results of Box-Behnken Design

以葡萄籽總黃酮萃取率Y為響應值，根據表2的試驗結果，用Design-Expert7.0軟件進行多元回歸分析，具體結果見表3。經回歸擬合后，試驗因子對響應值的影響可用以下回歸方程表示:

回歸分析見表3。由表3可知，模型P=0.000 3＜0.05，說明模型擬合程度極顯著。失擬項 P=0.064 0＞0.05，失擬項不顯著，模型決定系數為96.54%，說明回歸方程擬合程度較好。該模型中A、B、A2、C2極顯著，C、B2顯著，其他項系數均不顯著，從表3可看出，A、B、C對黃酮萃取率均有一定影響，按照對結果的影響排序:pH(B)＞粗提液質量分數(A)＞NaCl質量分數(C)。

表3 Box-Behnken試驗結果的回歸分析Table 3 The regression analysis of Box-Behnken experiment results

2.6.2 響應面交互作用分析與優化

利用Design-Expert軟件根據回歸方程進行響應面分析，繪制等高線圖，結果如圖6所示，利用Design-Expert軟件對黃酮萃取率的二次多項式數學模型進行求導，可獲得該模型極值點，對函數進行分析，獲得了各個因素的最佳條件組合:pH 7.2、NaCl質量分數1.97%、粗提液質量分數21.3%。此時模型預測極大值為96.437 2%。

圖6 各因素交互作用的等高線圖Fig.6 Response plots for the pairwise interactive effects

2.6.3 驗證試驗

在雙水相體系組成不變情況下，在優化條件下進行3組試驗，黃酮萃取率平均達到98.8%，與模型預測值接近，說明該模型能準確預見實際萃取情況。

3 結論

雙水相體系中乙醇、硫酸銨質量分數、pH值、粗提液質量分數、NaCl質量分數對黃酮萃取率和分配系數均有影響。確定雙水相體系組成23%無水乙醇-17%(NH4)2SO4;葡萄籽黃酮所需的最佳萃取條件為:粗提液質量分數21.3%、pH 7.2、NaCl質量分數1.97%，萃取率達到98.8%;該法方法簡單，易于掌握，采用低毒的無水乙醇，利于環保且節約試劑。

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