超聲波輔助提取中華苦荬菜多酚工藝優化及不同干燥方式對其得率的影響*

石同同，陳瑩瑩，王頡，孫劍鋒，鄭乾魏

1(河北農業大學食品科技學院，河北 保定，071000)2(河北農業大學園藝學院，河北保定，071000)

中華苦荬菜(Ixeris chinensis(Thunb.ex Thunb.)Nakai)含有豐富的營養成分和生理活性物質，具有較高的營養價值和保健作用，也是一種藥食共用的植物［1］。中華苦荬菜在我國分布廣泛，野生資源豐富，食用、藥用歷史悠久，其化學成分及藥理作用復雜［2－3］。多酚類物質是一族在結構中含有酚的化合物，屬于植物的次生代謝產物［4］，有研究報道，植物多酚具有清除體內自由基、抗凝血、抗炎、防癌以及預防心血管疾病等多種作用。中華苦荬菜中所含成分十分復雜，常用提取多酚的方法有煎煮法、回流法、浸漬法，它們具有提取時間長、提取率低且多酚等活性成分損失量大等缺點。超聲波破碎細胞提取法是近幾年新興的提取方法，具有選擇性高、提取時間短、提取率高、消耗溶劑少等優點［5］，本試驗采用響應面優化法確定中華苦荬菜多酚超聲提取最佳條件，并對真空冷凍干燥、紅外干燥、自然陰干、烘干及自然曬干的中華苦荬菜多酚得率進行了測定。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

中華苦荬菜，采自河北農業大學校園內，經河北農業大學生命科技學院馮大嶺教授鑒定，沒食子酸，福林酚，無水乙醇，碳酸鈉均為市售分析純。

kq-500de型細胞超聲破碎儀，昆山市超聲儀器有限公司;WFZ-UV-2800紫外-可見分光光度計，尤尼科儀器有限公司;真空冷凍干燥機;HW-3型紅外干燥箱;DL-101-2型電熱鼓風干燥箱，天津市中環實驗電爐有限公司;TB-215D分析天平，賽多利斯股份有限公司(德國，感量為十萬分之一)。

1.2 中華苦荬菜處理方法

新鮮中華苦荬菜洗凈，50℃條件下烘干至恒重，粉碎后過40目，準確稱取中華苦荬菜干粉2.000 g，放入一定體積的乙醇溶液，放入超聲波破碎儀，提取后抽濾，抽濾液用60%乙醇定容到50 mL容量瓶得到中華苦荬菜提取液，再將此提取液稀釋10倍，精密稱取試驗中稀釋后的提取液1 mL，分別加入0.5 mL福林試劑、2 mL質量分數10%Na2CO3溶液，定容至10 mL，室溫下反應2 h。在760 nm出測定反應液的吸光度。

1.3 沒食子酸標準曲線確定

采用 Folin-ciocalteu 法測定總多酚含量［6－7］。稱取25 mg沒食子酸，加入到25 mL去離子水中，得到1 mg/mL的沒食子酸溶液。吸取5 mL 1 mg/mL的沒食子酸溶液，定容至50 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL 的沒食子酸溶液，然后配成 0，20，40，60，80，100 μg/mL的沒食子酸標液分別標號0～6。取不同標樣沒食子酸溶液1 mL，分別加入0.5 mL福林試劑、2 mL 10%Na2CO3溶液，定容至10 mL，室溫下反應2 h，以0號管為空白用紫外可見分光光度計測定各溶液在760 nm處吸光度，以吸光度(y)為縱坐標，沒食子酸濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線。

1.4 試驗設計

1.4.1 單因素試驗設計

準確稱取處理后的中華苦荬菜干粉2.000 g，放入一定體積的乙醇溶液，放入超聲波破碎儀，分別加入不同體積分數的乙醇，按照不同的提取時間、不同的料液比進行超聲提取，提取結束后抽濾，抽濾液用60%乙醇定容到50 mL容量瓶中。提取液按照1.2測定提取液吸光度。以標準曲線法計算中華苦荬菜多酚得率，分別確定最適的乙醇體積分數、超聲時間和料液比。

1.4.2 響應面試驗及優選

根據乙醇體積分數、超聲時間和料液比3個單因素試驗所確定的水平范圍，使用Design-Expert 7.1.3為輔助手段設計響應面試驗，選取Box-behnken模型，以多酚得率為響應值，做三因素三水平共17個試驗點(5個中心點)的響應面分析試驗。確定中華苦荬菜最佳的提取條件。

1.5 中華苦荬菜干燥方法的選擇

1.5.1 真空冷凍干燥

將采集的中華苦荬菜全草洗凈，放入真空冷凍干燥機的冷凍室，迅速降溫至－40℃，保持1 h。再將凍結的中華苦荬菜放入真空干燥室，干燥8h，至樣品質量不再發生改變，取出凍干的中華苦荬菜粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.5.2 紅外干燥

將采集的中華苦荬菜全草洗凈放入HW-3型紅外干燥箱，干燥2 h，干燥結束取出粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.5.3 陰干

將采集的中華苦荬菜全草洗凈，放置到背陰處，48 h后干燥結束，將陰干的中華苦荬菜粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.5.4 烘干

將采集的中華苦荬菜全草洗凈，50℃條件下烘干至恒重，粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.5.5 曬干

將采集的中華苦荬菜全草洗凈，放到太陽直射下，10 h后質量不再發生變化，干燥結束粉碎后過40目，抽真空包裝后備用。

1.6 多酚得率的計算

根據標準曲線法將所測定的中華苦荬菜提取液的吸光度帶入回歸方程計算多酚的提取率。首先將所測得的吸光度帶入回歸曲線，計算此時所測定反應液的多酚濃度x(μg/mL)。

總得率z=x×500/(2×1 000×1 000)。

其中，500為稀釋倍數，2×1 000×1 000為稱取中華苦荬菜質量(μg)。(此公式僅適用于此試驗)。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線的繪制

根據沒食子酸不同濃度標準液得到的吸光度，以吸光度(y)為縱坐標，沒食子酸濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線。結果表明沒食子酸濃度在0～100 μg/mL內線性關系良好。如圖1所示，回歸方程為y=0.011 2x+0.026 5，R2=0.995 7。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 超聲提取多酚單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對多酚得率的影響

精確稱取中華苦荬菜粉末2.000 g，在料液比1∶20(g∶mL)，提取1 h條件下，分別加入體積分數為30%、45%、60%、75%、95%的乙醇溶液，進行超聲破碎提取1 h后，按1.2方法測定，并計算多酚得率。試驗結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數對得率的影響Fig.2 Effects of alcohol concentration on extraction rate

從圖2可知，隨著乙醇體積分數的增大，多酚得率逐漸升高，當乙醇體積分數為60%時，多酚的得率達到最大，總得率為1.91%，當乙醇體積分數繼續增大時，多酚得率開始下降，主要原因可能是隨著乙醇體積分數的不斷增大，溶液的極性逐漸增大，而中華苦荬菜中多酚物質的極性是基本恒定的，根據相似相溶原理，當乙醇體積分數增大到60%時，如果再繼續增大，則提取液中因為水極性增大導致提取率開始下降，從而使多酚得率降低。因此選擇適宜的乙醇體積分數為45%、60%、75%。

2.2.2 超聲提取時間對多酚得率的影響

精確稱取中華苦荬菜粉末2.000 g，在料液比1∶20(g∶mL)，乙醇體積分數為60%時，分別提取15、30、45、60、75、90 min，按照 1.2 方法進行測定，并計算多酚得率。試驗結果見圖3。

圖3 超聲時間對得率的影響Fig.3 Effects of processing time on extraction rate

從圖3可知，隨著超聲提取時間的增加，多酚得率逐漸升高，當超聲提取60 min時，中華苦荬菜多酚得率達到最大，此時得率為1.93%。當提取時間超過60 min時，多酚得率差異性不顯著，這可能是超聲提取時間過長，導致中華苦荬菜細胞組織破壞，一些不溶性的雜質溢出，從而阻止了多酚成分的溶出。因此選擇適宜的超聲時間為45、60、75 min。

2.2.3 料液比對多酚得率的影響

精確稱取中華苦荬菜粉末2.000 g，在乙醇體積分數為 60%時提取 1 h，分別考察料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)對中華苦荬菜多酚得率的影響。試驗結果見圖4。

圖4 料液比對得率影響Fig.4 Effects of material-liquid ratio on extraction rate

從圖4可知，隨著料液比的逐漸增大，中華苦荬菜多酚得率逐漸增大，當料液比為1∶20(g∶mL)時，總得率達到最大，為1.89%。繼續增大料液比，多酚的得率差異性不顯著。分析原因可能是由于在超聲波的作用下，中華苦荬菜中所含多酚類物質已經最大限度溶出，當料液比進一步增大時，其他雜質進入浸提液，從而阻止了多酚成分的溶出。因此選擇最適的料液比為 1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)。

2.3 響應面法優化中華苦荬菜多酚提取工藝

根據Box-behnken中心組合試驗設計原理，綜合單因素所得試驗結果，選取乙醇體積分數、超聲時間和料液比3個因素，采用三因素三水平的響應面分析方法，因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factorlal levels of RSD

表2 響應面分析方案及結果Table 2 Design scheme and results of central composite test

應用Design-Expert軟件進行多元回歸擬合分析，得到中華苦荬菜多酚得率與各因素變量的模型Y=1.87+0.18A+0.056B+0.071C+0.067AB－0.013AC+0.030BC－0.36A2－0.057B2－0.18C2。

運用軟件對17個響應值進行回歸分析得到方差分析表，如表3所示，整體模型P＜0.01，該二次方程模型達到了極顯著水平，并且失擬項不顯著說明該方程對試驗擬合較好。分析表3可知A乙醇濃度對多酚得率達到極顯著水平(P＜0.01)，C料液比對多酚得率達到顯著水平(P＜0.05)，二次項A2、C2對中華苦荬菜多酚得率曲面效應極顯著，交叉項對多酚得率 的影響也較顯著。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of extraction rate of flavonoids

2.4 響應面曲面分析

根據回歸方程，做出響應面圖(見圖5～圖7)，考察所擬合的響應面的形狀，分析乙醇體積分數、超聲時間以及料液比對多酚得率的影響。

圖5 F(A，B)響應面立體圖Fig.5 F(A，B)Response surface perspective view

圖6 F(A，C)響應面立體圖Fig.6 F(A，C)Response surface perspective view

從圖5～圖7可見，乙醇體積分數是影響多酚得率的主要因素，料液比對其得率的影響次之，超聲時間對其得率的影響較小。在模型濃度的范圍內選擇出發點，按照模型使用快速上升法進行優化，可得中華苦荬菜多酚提取的最佳方案為乙醇體積分數60%，超聲時間60 min，料液比1∶20(g∶mL)，在此工藝條件下，中華苦荬菜多酚得率的預測值為1.86%。

圖7 f(B，C)響應面立體圖Fig.7 F(B，C)Response surface perspective view

2.5 最佳提取條件驗證試驗

為檢測響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化條件乙醇體積分數60%，超聲時間60 min，料液比1∶20(g∶mL)，實際平均得率為1.85%，與理論值基本相符。

2.6 不同方法干燥的中華苦荬菜多酚得率測定

按照中華苦荬菜多酚的最佳超聲提取條件，分別測定真空冷凍干燥、紅外干燥、陰干、烘干以及曬干的中華苦荬菜中多酚得率，如圖8所示。

圖8 干燥方式對得率的影響Fig.8 Effects of drying methods on extraction rate

試驗結果表明，真空冷凍干燥的中華苦荬菜多酚得率最高，為3.22%，曬干的中華苦荬菜多酚得率最低，為1.23%，干燥效果依次為凍干＞紅外干燥＞烘干＞陰干＞曬干。由此可知，直射光線及空氣中長時間放置對多酚得率的影響非常大，容易使多酚含量因氧化而降低。真空冷凍干燥中華苦荬菜在干燥前始終處于低溫(凍結狀態)，同時冰晶均勻分布于中華苦荬菜中，升華過程不會因脫水而發生濃縮現象，避免了由水蒸氣產生泡沫、多酚的氧化等副作用，因此真空冷凍干燥方式所得的多酚得率最高。紅外干燥時中華苦荬菜內部水分的濕擴散與熱擴散方向是一致的，從而加速了水分內擴散的過程，也即加速了中華苦荬菜的干燥進程，因此短時間內就可干燥結束，從而避免多酚含量的降低。但是考慮到真空冷凍干燥能耗高，干燥時間長等缺點，而紅外干燥具有干燥效率高，活性成分損失少等優點，因此建議生產上采用紅外干燥的方式，同樣能得到較高的多酚含量。

3 結論

采用超聲波輔助提取技術對中華苦荬菜多酚進行提取，通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設計及響應面分析對超聲波提取工藝進行優化，得出較優工藝條件為乙醇體積分數60%，超聲時間60 min，料液比1∶20(g∶mL)，此時多酚得率可達1.85%。用最佳提取條件分別對真空冷凍干燥、紅外干燥、自然陰干、烘干及自然曬干的中華苦荬菜中的多酚得率進行測定，試驗結果表明真空冷凍干燥的中華苦荬菜多酚得率高，為3.22%，曬干的中華苦荬菜多酚得率低，為1.23%，不同干燥方式得率的大小依次為凍干(3.22%)＞紅外干燥(3.05%)＞烘干(1.98%)＞陰干(1.75%)＞曬干(1.23%)。

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