物理預處理改善食品蛋白酶解特性的研究進展*

陳林，吳克剛，柴向華，余林，劉曉麗，陳琰華

(廣東工業大學輕工化工學院食品系，廣東廣州，510006)

蛋白質酶解是利用蛋白水解酶在溫和條件下催化蛋白質水解成氨基酸和小肽。酶解反應速度快，條件溫和，專一性強，無氨基酸破壞和有害物質產生，無環境污染，故被認為是水解食品蛋白的最佳方法。蛋白質經適度酶解后除了保留甚至提高其生物價外，功能特性明顯優于原始蛋白質;利用蛋白質酶解制備生物活性肽更是成為國內外研究的熱點。然而由于許多食品蛋白特殊的組成和結構，蛋白分子高度壓縮、結構緊密，對蛋白酶的水解作用具有很強的抵抗力。近年來，許多研究都發現在酶解前采用適當的物理預處理，使蛋白變性或改變其組成及結構，可顯著地改善許多食品蛋白的酶解敏感性，從而提高水解度(DH)、縮短酶水解時間、提高酶的利用率、并使有效產物的得率大大提高。此外，物理預處理技術具有操作簡單、無毒副作用、對營養破壞小等優點，非常適合于在食品工業中應用。因此，物理預處理對食品蛋白酶解特性的影響已越來越受到食品科學領域學者的關注。本文擬對國內外用于促進食品蛋白酶解的物理預處理技術的作用機理、影響因素、應用優缺點等方面的研究進展做一綜述。

1 蛋白酶解的物理預處理技術

物理預處理是利用熱、微波、聲能、高壓、機械能等物理作用形式，對蛋白質進行處理從而改變其結構和性質，使更多的酶解位點得以暴露而與蛋白酶作用，從而促進蛋白酶解。事實上，物理預處理與物理改性的原理相同，只是物理預處理的目的是改善蛋白酶解敏感性，而物理改性的目的是改善蛋白功能特性。根據文獻報道，目前常用的物理預處理主要有加熱、超聲波、擠壓、超高壓和高速剪切。

1.1 加熱預處理

酶水解蛋白前進行加熱處理是一種常用的預處理方法。加熱處理可以破壞氫鍵、疏水相互作用和范德華力等次級鍵，通過變性使蛋白質成為松散的結構，原來包埋于內部的酶水解位點被暴露。但是由于蛋白質結構相互差異很大，因此加熱變性的效果也隨蛋白質的不同而變化。有研究表明許多植物蛋白(如大豆蛋白［1－2］，花生蛋白［3］，大麻蛋白［4］，油菜籽蛋白［5］)在熱變性后比原始蛋白更容易被酶水解，因為植物蛋白經過適度熱處理后，維系其蛋白空間結構的氫鍵、疏水相互作用、范德華力等次級鍵遭到破壞，引起酶解位點暴露，有利于酶的攻擊，使植物蛋白的水解更容易進行。如陶紅等［1］發現大豆蛋白經過90℃水浴加熱10 min，其水解度由未經熱處理的12.0%提高到20.3%，這說明適當的加熱預處理可以顯著提高植物蛋白的酶解敏感性。

但是動物蛋白在熱變性后酶解敏感性往往會下降。如Mohr［6］報道了魚肉蛋白熱變性后不利于被酶作用轉化成可溶性氮;段振華等［7］研究發現鳙魚下腳料在酶解前熱處理其水解度明顯低于不經熱處理的樣品。這可能是因為動物蛋白(肌球蛋白、肌動蛋白)富含巰基(—SH)，而植物蛋白(如小麥面筋蛋白、玉米蛋白)中硫主要以二硫鍵(—S—S—)形式存在，所以動物蛋白經熱處理后，往往導致—SH破壞(半胱氨酸、胱氨酸間氧化縮合)，形成更穩定的—S—S—鍵，不利于水解酶的作用，引起蛋白酶解敏感性的降低［8］。此外，無論對哪種蛋白，必須掌握好適當的熱處理程度，溫度過高或加熱時間過長，都會使已變性展開的蛋白分子因疏水相互作用或形成－SS－導致致密的網狀結構形成，酶解位點反而被包埋［3－4］。

加熱預處理的方式主要有水浴法、水熱法和微波加熱。水浴法以水為介質，在常壓條件下對蛋白進行加熱處理。水熱法是在密閉的壓力容器中(如高壓滅菌鍋)，以水或其他液體作為介質，在高壓條件下對蛋白進行加熱處理。在水熱法中，由于蛋白質同時經歷高溫、高壓2種作用，因此會發生一些常壓加熱不會出現的變化。如Radha等［2］在酶解前對商品化大豆分離蛋白分別進行水浴法加熱(90℃)和水熱法加熱(121℃，9.8 MPa)，結果發現水浴法加熱預處理對商品化大豆分離蛋白的酶解敏感性沒有顯著影響;但是水熱法加熱預處理卻有明顯的改善效果。原因可能是高溫和高壓相聯合對破壞大豆蛋白中的二硫鍵具有協同增效作用，因此可使已發生變性聚集的蛋白分子展開［9］。

微波加熱利用頻率108～1011Hz的電磁波產生交變電磁場，使物料中極性分子產生高速取向運動，相互摩擦，溫度急劇升高，從而達到加熱的目的。目前已有研究報道了微波加熱預處理可以改善大豆蛋白［10－11］、蛾豆蛋白［12］的酶解敏感性。影響微波加熱預處理效果的重要因素是微波功率和加熱時間。齊蓮子等［10］在酶解前采用微波加熱對脫脂豆粕進行預處理，結果發現最佳預處理條件是:微波功率420 W，處理時間2 min，該條件下水解度提高了2.0%;如繼續增大微波功率或延長加熱時間，水解度反而會下降。根據文獻報道，微波加熱預處理對蛋白質酶解的促進效果與水浴加熱接近，但微波加熱所需的時間更短［11］。這是因為微波是一種電磁波，對物料具有穿透性，可使物料內部和外部同時受熱。因此微波加熱與常規加熱方式相比，具有加熱迅速的優點，對固體和半固體等存在加熱溫度梯度的食品尤為有效。

1.2 超聲波預處理

超聲波可分為2類:一類是高頻率低振幅超聲波(頻率范圍5～10 MHz)，這種超聲波的能量比較小，一般小于1 W/cm2，可用于食品的無損檢測，因此也被稱為檢測超聲波。另一類是低頻率高振幅超聲波(頻率范圍20～100 kHz)，這種超聲波的能量很大，可達10～1000 W/cm2，因此被稱為功率超聲波。功率超聲波在介質傳播時具有空化效應，可產生高速微射流、強烈沖擊波和局部高溫，具有改變物質理化性質和結構的能力。功率超聲波是一種用途廣泛的新興食品加工技術，已在食品工業中被用于殺菌、乳化、提取、干燥、加速氧化等。功率超聲波有2種處理方式——探頭式超聲技術和槽式超聲技術。探頭式超聲對液態樣品進行處理時，超聲探頭直接浸入液體，其聲強可達數百W/cm2。槽式超聲對液態樣品進行處理時，反應液可直接裝入槽內，但聲波經過反射、衰減等損耗，真正作用于反應液的聲強較小。在目前的文獻報道中，對食品蛋白(如大豆蛋白［11，13－14］、花生蛋白［15］、小麥面筋蛋白［16］、酪蛋白［17］)的酶解預處理多采用探頭式超聲技術，因為探頭式超聲比槽式超聲的功率密度大［18］。

超聲波的功率是影響蛋白酶解敏感性的重要因素。本課題組采用28 kHz超聲波對大豆分離蛋白進行預處理，結果發現在超聲波功率為400 W時，水解度最大(提高了3.1%);之后隨著功率的增大，水解度逐漸下降［13］。這說明預處理時超聲波功率也不是越大越好，功率過大可能導致蛋白變性聚集，反而不利于蛋白酶解。除了功率外，超聲波的作用效果還受處理時間、樣品溫度、pH 等的影響［14－17］。有研究表明，超聲波可以破壞蛋白分子內或分子間的疏水作用和范德華力，但對氫鍵和二硫鍵影響卻很小，因此超聲波對蛋白分子結構的影響與熱效應不同［18］。云田田等［11］比較了加熱(水浴、微波)和超聲波對大豆粕蛋白酶解敏感性的影響，結果發現超聲預處理的效果不如加熱預處理。原因可能是超聲波對蛋白質的三級和四級結構有破壞作用，但對其二級結構影響較小，因此只能使蛋白部分展開。

1.3 擠壓預處理

擠壓技術是現代食品加工的高新技術之一，擠壓機集加熱、加壓、剪切、膨化等多種單元于一體，且擠壓過程在極短時間內就可完成。在擠壓機筒內，蛋白原料在高溫(100～200℃)、高壓(2～10 MPa)作用下，發生包括共價鍵、二硫鍵、肽鍵和次級鍵在內的復雜化學反應，使蛋白失去原有結構，物料形成連續的塑性‘熔融體’;在螺桿剪切作用下，‘熔融體’中蛋白分子呈現線性定向排列(纖維狀);最后由模頭擠出時，物料從高壓高熱狀態突然進入大氣常壓環境中，擠出物因此釋放出大量過熱蒸汽，發生膨化作用。從物理特性來說，擠壓使蛋白原料轉變成膨松和多孔狀的結構;從化學觀點來說，擠壓使原料中的蛋白重新組合成有一定結構的纖維狀蛋白體系［19］。

目前國內外已有不少研究報道了擠壓預處理對大豆蛋白［19－21］、玉米蛋白［22］、小麥面筋蛋白［23］、蕓豆蛋白［24］的酶解敏感性的影響。如 Marsman等［19］發現在雙螺桿擠壓過程中大豆分離蛋白的結構會發生變性重組，由球狀聚集態重組為伸展纖維狀，更多的酶切位點因此暴露出來，蛋白的酶解敏感性得以提高。本課題組之前的研究比較了超聲、超高壓、擠壓3種預處理對商品化大豆分離蛋白酶解敏感性的改善效果，結果發現擠壓預處理的效果最好［19－20］。這可能是因為擠壓預處理對蛋白的改性作用比較強，不僅可以破壞次級鍵，而且可以破壞二硫鍵、肽鍵等共價鍵，并使蛋白結構發生重組，形成易于酶解的結構。因此對于已經發生變性聚集的商品化大豆分離蛋白，擠壓預處理也能顯著改善其酶解敏感性。

擠壓預處理效果與擠壓過程的溫度、物料含水量和螺桿轉速密切相關。如柴華等［23］研究發現擠壓預處理中各因素對小麥面筋蛋白酶解敏感性的影響主次關系為:螺桿轉速＞物料含水量＞溫度;最優擠壓預處理工藝條件是:螺桿轉速130 r/min、物料含水量50%、溫度145～150℃，小麥面筋蛋白的水解度由未經擠壓處理的6.93%提高到15.49%。本課題組發現擠壓預處理溫度對大豆分離蛋白的酶解敏感性有顯著影響;最優處理溫度是160℃，大豆分離蛋白的水解度由未經擠壓預處理的 4.5%提高到11.3%［20］。可見，適當的擠壓預處理對食品蛋白是一種非常有效的酶解預處理技術。

1.4 超高壓預處理

超高壓(＞100 MPa)可使維系生物高分子立體結構的非共價鍵破壞，并誘導分子構象進行重排，從而對其結構和性質產生影響。根據處理方式的不同，可分為靜高壓和動態高壓(高壓均質)。

據報道，靜高壓處理對許多食品蛋白(如大豆蛋白［25］、β－乳球蛋白［26－27］、卵清蛋白［28］、雞蛋清蛋白［29］)的酶解敏感性都有改善作用，且作用效果與處理壓力密切相關。如Chicón等［28］發現當靜高壓預處理的壓力達到200 MPa，β－乳球蛋白的水解度才有顯著提高;而Jung等［25］發現，當靜高壓預處理的壓力達到500 MPa，大豆粕蛋白的水解度才有顯著提高。有研究表明，靜高壓可以破壞蛋白分子內或分子間的疏水相互作用、范德華力等次級鍵，但二硫鍵對靜高壓不敏感［27，30］。如 Kieffer等［30］研究發現當靜高壓達到1 000 MPa時，小麥面筋蛋白的二硫鍵才開始被破壞。因此對含有較多二硫鍵的食品蛋白(如小麥面筋蛋白、玉米蛋白、鷹嘴豆蛋白等)，靜高壓預處理的效果可能不顯著。如Zhang等［31］發現鷹嘴豆分離蛋白經過靜高壓預處理(200～600 MPa)后，其水解度沒有顯著變化。

靜高壓處理時樣品僅僅產生高壓誘導的變化，而在高壓均質過程中，劇烈的處理條件如高壓、強烈剪切、空穴爆炸、高頻振蕩等機械力的綜合作用將導致物料分子結構發生更顯著的變化。此外，高壓均質可連續操作，是工業化生產的有利條件，因此被認為是食品加工中最有潛力和發展前途的物理改性技術之一。目前已有研究報道了高壓均質對食品蛋白酶解敏感性的影響。如Dong等［32］發現高壓均質預處理在40 MPa壓力下就可顯著提高花生蛋白的酶解敏感性。陳劍兵等［33］也發現高壓均質預處理對油菜籽蛋白的酶解有促進作用，且隨著壓力的增大(0～120 MPa)作用效果越明顯。

1.5 高速剪切預處理

目前有學者研究了高速剪切預處理對大豆蛋白［10，34］、玉米蛋白［35］的酶解敏感性的影響。如郭維靜［35］等發現玉米蛋白粉分散液經高速分散均質機剪切預處理后，底物顆粒粒徑顯著減小，水解度顯著增大。據報道，高速剪切作用可破壞蛋白聚集體和蛋白質分子的高級結構，使原本被包埋的酶解位點暴露出來，有利于酶的攻擊，從而促進蛋白的酶水解［10］。

影響高速剪切預處理效果的重要因素是樣品黏度、剪切速率和剪切時間。高速剪切預處理通常不適用于黏度較大的蛋白樣品，因為樣品黏度越大，剪切細化的效果越差［35］。在一定范圍內，剪切速率越大、剪切時間越長，底物顆粒的粒徑越小，越有利于提高蛋白的酶解敏感性;但是如果剪切速率過高或剪切時間過長，都會使樣品溫度升高，導致蛋白過度變性，形成不溶性蛋白聚集體，反而不利于酶水解［10］。齊蓮子等［34］采用高速組織搗碎機對大豆分離蛋白分散液進行高速剪切預處理，結果發現在最優處理條件下(蛋白濃度100 g/L、剪切速率6 000 r/min、剪切時間4 min)，其水解度提高了2.87%。

2 幾種蛋白酶解物理預處理技術的比較

不同物理預處理技術的作用機理和設備不盡相同，因此對蛋白結構的影響也不同，所適用的蛋白原料也不同。如何選擇合適的物理預處理技術和處理工藝條件，對于改善食品蛋白的酶解敏感性是十分重要的。從表1可以看出，目前報道的蛋白酶解預處理技術各有利弊，在本文之前的部分也做了較為詳細的分析探討。目前從實際對食品蛋白酶解敏感性的改善效果來看，水熱法和螺桿擠壓的效果最好。它們對許多食品蛋白的酶解敏感性有明顯的改善效果，甚至可以提高已變性聚集蛋白的酶解敏感性。由于商品化蛋白原料大都經過噴霧干燥、高溫殺菌等高溫熱處理，蛋白已發生變性聚集。因此水熱法和擠壓預處理可用于改善商品化蛋白原料的酶解敏感性，在蛋白酶解工業化生產中有良好的應用前景。但是這2種方法也都還有缺點，需要進一步改進。比如水熱法預處理對設備要求高，操作較復雜;而擠壓預處理使食品品質和風味發生變化。值得注意的是，這2種技術都集成了幾種物理作用相互配合(其中水熱法處理中物料同時經歷高溫、高壓2種作用;擠壓處理中物料同時經歷高溫、高壓、剪切、膨化)，對蛋白結構有很強的破壞效果，而且還可誘導蛋白重組，形成易于酶解的結構形態。因此合理地將協同增效顯著、工序銜接性好、安全便捷的幾種物理作用相聯合，可以形成可行有效的復合預處理技術。

表1 幾種蛋白酶解物理預處理技術的比較Table 1 The comparison of several physical pre-treatment techniques used for protein enzymatic hydrolysis

目前已有學者研究了幾種物理預處理作用相聯合對食品蛋白酶解敏感性的影響。如Riener等［36］在酶解前采用‘熱超聲’對牛奶蛋白進行預處理(先將牛奶蛋白粉分散液水浴加熱到一定溫度，然后在此溫度下進行超聲波處理)，結果發現在溫度72℃、超聲波功率400 W，處理10 min，牛奶蛋白的水解度提高了3.2%;如果不加熱，水解度只提高了2.1%。樂堅等［37］將高速剪切(3 min)、高壓均質(20 MPa)、熱處理(90℃，10 min)聯合起來對商品化大豆分離蛋白進行預處理，結果發現水解度提高了5.4%。幾種物理預處理相聯合，對食品蛋白酶解敏感性的改善可能會產生協同增效作用，但同時也增加了成本，加大了操作難度。

3 展望

物理預處理可以改變蛋白分子的高級結構和分子間的聚集狀態，使其緊密的結構松散開，暴露出更多的酶解位點，或形成某種易于酶解的形態，從而提高了蛋白的酶解敏感性，因此物理預處理是實現食品蛋白質高效酶解的有效手段。此外，物理預處理無毒副作用，非常適合于在食品工業中應用。目前國內外已有不少物理預處理改善食品蛋白酶解敏感性的報道。許多物理預處理對蛋白質分子結構有明顯的影響，但是處理過程中蛋白結構變化以及處理后蛋白結構對其酶解特性的影響國內外研究很少，蛋白結構與其酶解敏感性的相關性研究還不深入，預處理對酶解產物功能特性的影響研究也較少。為了更好地對物理預處理和蛋白酶解加以控制，今后有必要進一步探索物理預處理后蛋白結構變化與酶解敏感性的內在關系。

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