臭鱖魚中優良乳酸菌的分離篩選與鑒定

羅靚芷，武俊瑞，劉佳藝，李欣，岳喜慶

(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽，110866)

臭鱖魚由鱖魚腌制而成，氣味特別，且保留了鱖魚的本味原汁，肉質醇厚，是我國獨具風味的傳統水產制品。因為水產制品生產的集中、季節性及原料的易腐性，采用腌制這種傳統加工方法，不僅保存了水產品豐富的營養價值，而且產生了獨特的口感和風味。將腌制水產制品中的優勢微生物分離篩選出來，應用于腌制水產制品的加工中，可縮短腌制水產制品的生產周期，提高產品質量與品質，因此，對腌制水產制品中優勢微生物的研究非常有必要。

乳酸菌能賦予腌制水產制品柔和的酸味和香氣，改善產品風味［1］，促進發酵的成熟［2］，提高制品的營養價值和功能性。從傳統水產制品中篩選優勢乳酸菌的研究國內外已有很多，近年來，國內外學者自傳統發酵魚制品［3］、北海淡口腌制金絲魚［4］、醉魚［5］、湘西傳統酸魚［6］、fish-nukazuke［7］、som-fak［8］，pleasom［9］和 Plasom［10］等中分離出乳酸菌，符合水產品發酵的生產要求。

本實驗以具傳統特色的臭鱖魚為原料，依據肉制品發酵劑的篩選標準［11］，從中分離篩選鑒定優良的乳酸菌菌株以及16S rDNA序列分析等實驗與研究，以期得到適合生產發酵魚肉制品的優良菌株，為開發新型臭鱖魚制品奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

臭鱖魚，購于安徽黃山市與沈陽市徽菜館。

1.2 主要培養基與試劑

MRS 培養基［12－13］;篩選培養基［14］;糖發酵細菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 儀器設備

電熱手提式高壓殺菌鍋，上海醫用核子儀器廠;XS-212生物顯微鏡，南京江南永新光學有限公司;CR-21G冷凍離心機，日本HITACHI日立;PHS-25型pH計，上海雷磁儀器廠;SP-2100UV型紫外分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司;DNA擴增儀，美國BIO-RAO。

2 試驗方法

2.1 菌株的分離培養

無菌操作，依據GB/T9695.19－2008，稱取臭鱖魚樣品10.0 g，用滅菌剪剪碎后加入裝有90 mL無菌水和一定數量玻璃珠的三角瓶中，振動搖晃30 min，以此作為稀釋度為10－1的樣品液。用無菌水做梯度稀釋。無菌吸取1 mL適宜濃度稀釋液至培養皿中，倒入適量含有2%的CaCO3的MRS固體培養基覆蓋稀釋液，輕輕轉動平板，使菌液與培養基混合均勻，冷凝后倒置，37℃培養48 h。

肉眼觀察，選取分布較好的平板，挑取分離較好的有代表性的單獨菌落，經多次劃線分離直至獲得純菌落。將純化后的疑似菌落培養物接種于MRS斜面培養基上，37℃分別培養24 h后，置于4℃冰箱內保藏待用。

2.2 菌株的形態學觀察

觀察平板上疑似菌落的形態、大小、色澤等。

挑取疑似菌落培養物涂片，進行革蘭氏染色試驗和過氧化氫酶檢驗，于×100倍油鏡下觀察細菌的染色結果和疑似菌株的形態。

2.3 優勢乳酸菌的篩選與生理生化特征的鑒定

根據肉制品發酵劑的篩選標準［11］進行產黏性試驗、耐鹽性試驗、耐亞硝酸鹽試驗、耐酸性試驗、葡萄糖產氣試驗、產H2O2試驗、產H2S試驗、石蕊牛奶酸凝試驗、產氨試驗、硝酸鹽還原試驗、M.R試驗、V.P試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、耐高低溫試驗(15℃、45℃)、運動性試驗、糖醇發酵試驗。

2.4 菌株的生長曲線和產酸能力試驗

將鑒定出的菌株分別接種于MRS液體培養基，37℃培養24 h。每4 h測1次。用可見光分光光度計于640 nm下，測定菌液的吸光度值。pH值用pH計測定。

2.5 菌株的耐溫性試驗

不同菌株接種于其液體培養基中，分別置于15，20，25，30，35，40，45 ℃培養箱中培養 24 h，以不接種的液體培養基為空白對照，在640 nm條件下測底OD值。

2.6 16S rDNA序列分析

2.6.1 菌株DNA的提取

將篩選出菌株接種于MRS液體培養基中，37℃培養24 h，采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.6.2 16S rDNA基因序列PCR擴增及序列分析

16S rDNA擴增引物:應用細菌通用引物，正向引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1942R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

PCR擴增反應體系(50 μL):正向引物27F和反向引物 1942R 各 1.5 μL，dNTP(10 mmol/L)1.0 μL，10 × Buffer(2.5 mmol/L Mg2+)5.0 μL，ddH2O 39.0 μL，基因組 DNA 1.0 μL，Taq 聚合酶(5 u/μL)1.0 μL。

PCR陰性對照基因組DNA采用超純無菌水代替。

PCR擴增反應程序:95℃預變性5 min，95℃變性 30 s，52℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 30 s，經45次循環，72 ℃終延伸 7 min［15－18］。

PCR產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交北京擎科新業生物公司進行測序，測得的序列與NCBI數據庫已知序列進行比對及同源性分析，應用MEGA5.0軟件的鄰位相連(Neighbor-joining)法分析所測序列與GenBank中模式菌株16S rDNA序列，構建系統發育樹。

3 結果與分析

3.1 菌株形態學鑒定結果

采用MRS固體培養基，從臭鱖魚中分離出50株菌株，觀察菌落溶鈣圈、革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗結果，得到能產生溶鈣圈、革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶呈陰性的疑似乳酸菌11株，具體特征見表1。

表1 菌株形態學鑒定結果Table 1 Results of the morphological identification

根據表1的鑒定結果，所有的菌株都是呈乳白色、且菌落隆起表面光滑。分離純化得到的所有11株疑似乳酸菌有短桿狀、球狀，排列方式也不盡相同。

3.2 優勢乳酸菌的篩選與生理生化特征的鑒定

將分離純化得到的11株進行生理生化特征的鑒定試驗，結果如表2所示。

根據表2的生理生化鑒定結果，分離所獲得菌株11株菌中，只有 L4、L12、L20、L36符合肉制品發酵菌株指標的要求:不產黏液、能耐受6 g/dL NaCl;在pH 4.5和250 mg/dL NaNO2條件下正常生長;發酵葡萄糖不產氣;水解精氨酸不產氨;有良好的硝酸鹽還原能力;M.R反應陽性;V.P反應陰性;不能發生明膠液化反應;能水解淀粉;可在15℃和45℃下生長。

將篩選得到的4株菌株進行糖醇發酵試驗，具體結果見表3。

根據4株菌的表型特征和生理生化特點，檢索《伯杰細菌鑒定手冊》［19］(第八版)、《常見細菌鑒定手冊》［20］，可以初步判斷L4為屎腸球菌(Enterococcus faecium)、L12為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、L20為堅強腸球菌(Enterococcus durans)、L36為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。

表2 生理生化鑒定結果Table 2 Results of physiological and biochemical identification

表3 糖醇發酵試驗結果Table 3 Results of glycolysis test

3.3 菌株生長曲線

將篩選得到的4株優良乳酸菌接種于MRS液體培養基中培養，分析生長情況，見圖1。

圖1 乳酸菌生長曲線Fig.1 Growth curves of four lactic acid bacteria isolates

如圖1所示，L4在4～8 h生長速度明顯高于其他菌株［21］，在8～12 h時左右達到菌體密度最大值，之后進入穩定生長期，Herranz等人發現1株腸球菌在12 h時達到菌株密度最大值［22］，與之相符。其他菌株在培養到8～16 h生長速度明顯加快，培養到16 h后進入到穩定生長期。從圖1可以看出，篩選得出的4株菌均具備較強的生長能力。

3.4 菌株的產酸能力試驗

將篩選出的4株乳酸菌接種于MRS液體培養基中培養，分析其產酸能力，見圖2。

圖2 24 h內乳酸菌產酸能力Fig.2 Acid-producing capacities of four lactic bacteria isolates

如圖2所示，隨著培養時間的延長，4株菌株培養液的pH值均呈下降趨勢，培養初期pH值隨時間的變化不斷下降，培養16 h后，菌株培養液的pH值下降緩慢，與菌株的生長曲線大體一致。培養至24 h時，菌株培養液pH值可達到4.40以下。結合生長曲線與產酸能力，在臭鱖魚加工過程中，發酵初期腸球菌能迅速繁殖，產生乳酸，快速降低環境體系中pH值，為發酵與其他乳酸菌生長創造良好的條件。

3.5 菌株耐溫性試驗

將乳酸菌菌株接種于MRS液體培養基中，在不同溫度下培養，分析其耐溫性，見圖3。

圖3 乳酸菌在不同溫度下的生長情況Fig.3 Growing states of four lactic acid bacteria isolates at different temperatures

如圖3所示，4株菌在15～45℃下都能生長，在25～40℃下生長情況基本良好;45℃時腸球菌的生長情況相對于乳桿菌好。說明4株菌在25～40℃適宜生長。以目前臭鱖魚的傳統發酵工藝，發酵溫度為25～30℃，篩選出的4株菌能在此范圍良好生長。

3.6 菌株16s rDNA分析及系統發育樹的構建

3.6.1 菌株基因組DNA提取

利用天根細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取菌株的基因組DNA，并采用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，得到的檢測電泳圖只有1個條帶，如圖4所示，可進行16S rDNA基因序列PCR擴增。

圖4 菌株基因組DNA檢測電泳圖Fig.4 Electrophoretograms of DNA from four lactic acid bacteria isolates

3.6.2 16S rDNA基因序列PCR擴增

將菌株的基因組DNA進行16S rDNA基因序列PCR擴增，同時進行PCR陰性對照試驗，擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖5所示，PCR陰性對照無條帶，各菌株PCR產物條帶單一，在1 500bp處有特異性條帶，滿足測序的要求。

3.6.3 16S rDNA同源性分析及系統發育樹的建立

圖5 菌株PCR擴增凝膠電泳圖Fig.5 Electrophoretograms of PCR-amplification of 16S rDNA from four lactic acid bacteria isolates

利 用 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測定的4株菌株的16S rDNA序列，與GenBank/EMBL/DDBJ數據庫中已知細菌的16S rDNA/rRNA序列進行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。得到菌株L4的16S rDNA序列與屎腸球菌(Enterococcus faecium)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株 L12的16S rDNA序列與彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株L20的16S rDNA序列與堅強腸球菌(Enterococcus durans)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株 L36的16S rDNA序列與干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高。

從GenBank/EMBL/DDBJ數據庫中，提取已知的標準菌株的16S rRNA/DNA基因序列，利用MEGA5.0軟件構建系統發育樹，獲得目的菌的分類地位或它的系統發育地位。如圖6所示，菌株L4與屎腸球菌(Enterococcus faecium)的系統位置最接近，菌株L20與堅強腸球菌(Enterococcus durans)的系統位置最接近;菌株L12與彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的系統位置最近;菌株L36與干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的系統位置最接近。

圖6 優良乳酸菌L4、L12、L20、L36的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of four lactic acid bacteria isolates

根據16S rDNA同源性對比結果和系統發育樹，菌株L4鑒定為屎腸球菌(Enterococcus faecium)，L12鑒定為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)，L20鑒定為堅強腸球菌(Enterococcus durans)，L36鑒定為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。

4 結論

(1)依據肉制品發酵劑的篩選標準，本文通過對臭鱖魚中菌株的耐鹽、耐酸、耐亞硝酸鹽、產酸能力、生產曲線和耐溫性等一系列指標的研究，篩選出4株菌都符合肉制品發酵劑的標準，具有良好的生長性能和NaCl耐受性。

(2)經過生理生化鑒定與16S rDNA序列測定分析，鑒定L4為屎腸球菌，L12為彎曲乳桿菌，L20為堅強腸球菌，L36為干酪乳桿菌。為進一步探討乳酸菌在水產制品中的應用提供依據。

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