如皋火腿中耐亞硝酸鹽腐生葡萄球菌RG-2產氨肽酶條件的優化*

汪淼，王敏，張培培，吳雪燕，葛慶豐，吳滿剛，于海

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州，225127)

氨肽酶(EC 3.4.11.-)是一類從多肽鏈的N端順序水解氨基酸，使氨基酸逐個游離出來的酶的總稱，根據作用的底物不同，可分為亮氨酸氨肽酶、精氨酸氨肽酶、纈氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶等［1］。氨肽酶不僅能水解多肽，還能水解大分子蛋白，產生小分子多肽、氨基酸及改性蛋白等，還可切除苦味肽氨端的疏水氨基酸以脫除苦味［2］，也可促進形成降壓肽，故被廣泛用于肉制品和乳品加工中。Bolumar等［3］人探究了干式發酵香腸的成熟、風味等與其中微生物源氨肽酶的關系，并對精氨酸氨肽酶的酶學性質作了較為詳細的研究，研究表明，該氨肽酶的最適pH為7.0，最適溫度為37℃，不僅對含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基的多肽具有活力，而且對含亮氨酸、甲硫氨酸等非帶電氨基酸殘基的肽鏈及苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸殘基的肽鏈也具有一定的水解作用，特別是含上述氨基酸殘基的二肽，氨肽酶水解能力較高。Murai等［4］從日本神戶附近的Arima溫泉土壤中篩選得到1株產脯氨酸氨肽酶菌株Aneurmibacillus thermoaerophilus DSM10154T，該菌所產的脯氨酸氨肽酶可能是一種新型的能水解脯氨酰肽的氨肽酶，具有較好的熱穩定性，并可與另一種膠原蛋白酶協同作用以降解肉制品中的膠原質。Sato等［5］用11種蛋白酶處理酪蛋白水解液，發現亮氨酸氨肽酶可以脫去蛋白質酶解液的苦味;崔春等［6］利用由氨肽酶等組成的復合酶深度酶解藍園魚參蛋白，酶解6h后蛋白質的利用率即達到83.3%，21h時水解度達到59.7% 。

國內外報道的產氨肽酶的菌株主要有毛霉、米曲霉等霉菌以及枯草芽孢桿菌、乳桿菌等，而對于葡萄球菌屬產氨肽酶及其酶學性質的研究則鮮有報道。并且國內對于微生物源氨肽酶的應用研究主要集中在豆豉、腐乳以及乳制品方面，而對其在肉制品中的應用研究則很少。一些葡萄球菌作為發酵劑已經應用于發酵里脊肉、發酵鴨肉香腸等發酵肉制品的加工工藝中［7－8］，并研究了葡萄球菌產脂肪酶、蛋白酶等對發酵肉制品風味特性的影響［9］。但對與發酵肉制品良好滋味形成密切相關的氨肽酶的酶學性質研究還不夠深入，因此本文利用從如皋火腿中分離得到的1株耐亞硝酸鹽腐生葡萄球菌RG-2，通過單因素試驗及響應面設計方法等分析其產氨肽酶的發酵條件以及部分酶學特性，進而為利用腐生葡萄球菌開發肉品發酵劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)RG-2，由實驗室篩選保藏。NaNO2:國藥集團化學試劑有限公司(上海)，分析純;L-亮氨酸-對硝基苯胺(LNA)、L-精氨酸-對硝基苯胺(ANA)、苯丙氨酸-對硝基苯胺(PNA)，Sigma;對硝基苯酚(p-NP)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵培養基

MSA培養基的配制方法參照文獻［10］進行，亞硝酸鈉添加量(w/v，%):0.001，0.004，0.007，0.010，0.015，0.020，0.025，0.030

1.2.2 粗酶液及菌體的制備

將腐生葡萄球菌RG-2接種至MSA液體培養基37℃培養16 h后，調菌密度至1010CFU/ml，以1%接種量接至MSA液體培養基(添加1.2.1所述濃度的亞硝酸鈉)中，37℃，150 r/min搖床培養60 h，之后取此菌液2 mL，4℃、8 000×g離心15 min，得上清液(酶液Ⅰ);上述離心后沉淀用pH 6.0的TE緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA)洗滌 2 次，棄去上清液后再次加入2 mL pH 6.0的TE緩沖液后，在37℃保溫條件下處理3 h后用超聲波細胞破碎儀冰浴破碎，破碎條件:400 W，超聲5 s間隔5 s，120次。細胞破碎液4℃、8 000×g離心10 min，得上清液(酶液Ⅱ)。

選擇LNA、ANA、PNA等幾種硝基苯胺衍生物作為反應底物，進行底物特異性試驗。

1.2.3 蛋白濃度的測定

采用 Bradford 法［11］。

1.2.4 氨肽酶酶活的測定

取0.05 mL底物LNA(16.4 mmol/L)、酶液0.1 mL、2.85 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L、pH7.8)混合，在37℃下保溫60 min。用0.5 mL 30%乙酸終止反應，在405 nm處測定吸光度，蒸餾水為對照。酶活定義:37℃時，每分鐘生成1 μmol對硝基苯胺為1個活力單位［12］。

1.2.5 菌株產氨肽酶發酵條件的單因素試驗

在發酵劑制備以及肉制品發酵過程中，發酵劑中微生物的生長繁殖及產酶性能主要受亞硝酸鹽、發酵溫度、時間、鹽濃度等因素的影響。故設計在原有發酵培養基基礎上，進一步改變發酵時間、培養基初始pH、溫度、NaCl濃度等因素，確定菌懸液濃度及菌株產酶性能與各因素關系，以確定最佳發酵因素并達到為發酵肉制品發酵工藝提供參數依據的目的。

表1 單因素試驗設計表Table 1 Experiment design of single factors

固定培養溫度、pH、NaCl濃度3因素中的2個因素，按表1設計改變其中一個因素，以氨肽酶酶活為響應值，進行單因素試驗。

1.2.6 Box-Behnken試驗設計

根據Box-Behnken設計原理，以不同條件下的氨肽酶酶活為響應值，選取溫度、pH、NaCl濃度為影響因素，進行3因素3水平分析，共17個試驗點，其中5個為中心點。

1.2.7 數據處理

利用SPSS軟件對試驗數據進行統計學分析，響應曲面試驗數據采用Design Expert 8.0軟件對響應值進行多元回歸分析，建立回歸方程。對回歸模型結合三維響應面圖和等高線圖，判斷是否存在穩定點，據此得出最大酶活的主效因子條件，建立優化的催化條件并建立模型進行驗證。

2 結果與討論

發酵上清液(粗酶液)中的蛋白濃度為80 mg/L，細胞破碎液(粗酶液二)中的蛋白濃度為258 mg/L。氨肽酶酶活表示為U/mg。

2.1 亞硝酸鹽對菌株生長繁殖及產酶的影響

采用不同亞硝酸鹽的添加量，考察如皋火腿中功能性微生物的生長繁殖及產酶性能，如圖1所示。

圖1 亞硝酸鹽濃度對菌株RG-2發酵過程的影響Fig.1 The concentration of sodium nitrite on the fermentation process of S.saprophyticus RG-2

當培養基中亞硝酸鹽濃度低于0.010%時，菌體密度以及產酶都維持在較高的水平，酶活達到18 U/mg左右;而亞硝酸鹽濃度高于0.010%時，菌體濃度降低;而當亞硝酸鹽濃度高于0.015%時，菌株RG-2的產酶能力開始快速下降，當亞硝酸鹽濃度0.020%～0.030%時，菌株產酶能力趨于穩定，并達到11 U/mg左右。Bolumar等［3］利用從地中海干式發酵香腸中篩選的1株Debaryomyces hansenii CECT 12487進行產氨肽酶發酵試驗，結果表明該菌株在未進行酶純化條件下的產酶能力為3.0 U/mg。而Sanz等［13］通過分析自然發酵香腸中的1株功能性菌株清酒乳桿菌L.sake IATA115的產酶性能，得到其粗酶酶活大約為37.95U/mg。Sanz等［14］人還分析了另1株清酒乳桿菌L.sakei CECE4808，的發酵產酶性能，結果證明，該菌株的產酶能力約為2.1 U/mg。表明腐生葡萄球菌RG-2在未進行發酵條件優化時已具有較高的產酶能力，并且具有較強的亞硝酸鹽耐受性，可以應用于火腿、發酵香腸等加工過程中以改善肉品品質。

2.2 底物特異性

分別采用不同底物對酶液Ⅰ、酶液Ⅱ進行水解活性測定，以驗證該腐生葡萄球菌RG-2的底物特異性及產氨肽酶部位。

表2 氨肽酶的底物特異性Table 2 Substrate specificity of aminopeptidase from S.saprophyticus RG-2

由表2可知，各種底物實驗結果的胞外酶酶活均顯著高于胞內酶酶活，表明該類氨肽酶為胞外酶。該菌株所產氨肽酶對于底物LNA的分解效果最好，達到17.415 U/mg;其次為PNA，其酶活為11.025 U/mg明顯低于底物LNA;水解活性最弱的為ANA組。RG-2氨肽酶對不同底物的水解活性顯示出一定的差異。總的來看，該氨肽酶主要對小肽 N端疏水性氨基酸，如Leu、Phe構成的肽鍵有較強的水解活性;而對小肽N端非疏水性氨基酸，如Arg構成的肽鍵水解活性非常弱。比較底物水解活性來看，該氨肽酶對 Leu-pNA(LNA)有最大的水解活性，是一種亮氨酰氨肽酶。

2.3 菌株產氨肽酶條件優化

2.3.1 pH值

發酵溫度為37℃，NaCl濃度為2.5%，改變反應體系初始pH進行單因素試驗，菌密度及酶活結果如圖2所示，該氨肽酶的 pH-活性曲線相對較寬，而最適生長pH范圍卻相對較窄，pH值對其生長繁殖的影響非常顯著，最適產酶pH較最適生長pH小。在pH4.2～4.8范圍內，腐生葡萄球菌RG-2菌密度及所產氨肽酶酶活力隨pH增大略有上升，但均處于較低水平;當pH5.4～6.0時，菌密度及酶活隨pH增大快速上升，并在pH6.0時菌體產酶近最適pH，而繼續提高培養基初始酸度至pH6.6時，菌體RG-2生長繁殖及產酶能力均達到最大值，氨肽酶酶活達到17.4 U/mg;當pH大于7.2時，pH顯著抑制氨肽酶酶活，而對菌密度影響不明顯。

由此可知菌株RG-2產氨肽酶酶活的最佳pH為6.0～7.2，處于近中性范圍，當pH6.6～7.2時，菌株生長繁殖及產酶均為最佳值。而文獻報道的微生物產氨肽酶最適 pH 大約為 6.0 ～8.0［15－18］。

圖2 pH對菌株RG-2生長及產氨肽酶活力的影響Fig.2 Effect of pH values on the activity of aminopeptidase and growth from the strains RG-2

2.3.2 溫度

固定發酵液的pH為7.2，NaCl濃度為2.5%，改變發酵體系的初始溫度并進行單因素試驗，酶活測定結果如圖3所示。菌株RG-2的最適生長溫度(45℃左右)較最適產酶溫度(40℃左右)高。27～37℃時，菌株RG-2產氨肽酶能力及酶活隨溫度升高快速增加，當溫度近40℃時，氨肽酶酶活達到最大，而后隨溫度升高酶活迅速下降;而菌密度則在27～42℃隨溫度升高緩慢增加，45℃左右時，菌體生長繁殖達到最佳值;超過47℃，菌體生長及酶活都受到顯著抑制，可能是高溫抑制了菌體的生長繁殖導致菌密度較低，故產酶量較小，也可能高溫改變了氨肽酶結構。綜上，該氨肽酶的最適酶活溫度為40℃左右，最大酶活為17.55 U/mg，而菌株RG-2最適生長溫度則為45℃左右。

圖3 溫度對菌株RG-2氨肽酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of aminopeptidase and growth from the strains RG-2

為了使微生物的生長速度最快和代謝產物的產率最高，在發酵過程中必須根據菌種的特性，選擇和控制合適的溫度。多數報道的菌株產氨肽酶最適溫度為35～45℃［13－15］。本實驗菌株RG-2產氨肽酶的最適溫度可能為40℃左右，在37～42℃范圍內均具有較高的酶活，屬于中溫酶范疇。

2.3.3 NaCl濃度

根據單因素試驗結果，確定發酵液初始pH 7.2，反應溫度37℃，改變發酵體系的NaCl濃度進行單因素試驗，酶活如圖4所示。當NaCl濃度低于3%時，菌株RG-2能正常生長繁殖，并具有較高的產酶能力。其中當NaCl濃度約2%時，菌體生長繁殖達到最適鹽濃度，此時菌密度為4.6×1010，酶活為17.4 U/mg，而菌株酶活在NaCl濃度約1%時最高，酶活約為20.25 U/mg;當NaCl濃度高于3%時酶活快速下降，可能是此時環境鹽濃度雖然仍有利于菌體生長但已不適宜菌株產氨肽酶或高濃度鹽抑制了氨肽酶酶活;當鹽濃度超過4%時，NaCl表現出對菌體生長繁殖顯著的抑制作用。

圖4 NaCl濃度對菌株RG-2氨肽酶活力的影響Fig.4 Effect of concentration of NaCl on the activity of aminopeptidase and growth from the strains RG-2

NaCl濃度對于菌體產酶的影響依菌種不同差異較大，因為火腿、中式香腸等發酵肉制品均具有一定的鹽含量，所以研究NaCl濃度對于菌株生長繁殖及產酶的影響具有重要的意義。

2.4 響應面設計

運用Design expert8.0中的Box-Behnken進行試驗設計，如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設計Table 3 Experiment design of Box-Behnken

2.4.1 Box-Behnken試驗結果

設計Box-Behnken試驗方案，實施試驗，記錄試驗結果。p=3，試驗總次數N=17，響應曲面法的試驗設計及結果見表4。

回歸系數、回歸方程的顯著性檢驗以及擬合度檢驗結果見表5。由表5可知:模型極顯著(P＜0.000 1)，失擬項不顯著(P=0.534 4＞0.05)，說明該模型有較好的擬合度，可以用于腐生葡萄球菌產氨肽酶發酵條件的優化。對回歸系數顯著性檢驗可知，因素A和B、B和C之間的交互作用對菌株產氨肽酶的影響均極顯著(P＜0.05)，而其他一次項及二次項因素對菌株產氨肽酶的影響均極顯著(P＜0.01)。根據回歸系數，可得二次多項回歸方程:

Y=23.88+1.18A－2.20B+0.95C+0.99AB－2.04AC－0.72BC－1.32A2－6.07B2－5.00C2，其中R2=0.993 5。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果Table 4 Results of fermentation conditions by Box-Behnken test design

相關系數R2=0.993 5說明該回歸模型能夠解釋99.35%的該菌株發酵產氨肽酶酶水平的變化，回歸擬合程度較好。因此回歸方程給菌種的發酵產酶提供了一個合適的模型。

2.4.2 響應曲面分析與條件優化

以菌株RG-2產氨肽酶酶活為響應值，各因素水平均為標準函數，各因素間交互作用的響應曲面如圖5所示。

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance table

圖5 各因素交互影響菌株RG-2產氨肽酶的響應曲面和等高線圖Fig.5 Responding surface and contour plots for the interactive effect of different factors on the activity of aminopeptidase from strain RG-2

由圖5可知，AB、AC、BC交互作用均很顯著(P＜0.05)，失擬項不顯著(P＞0.05)，從響應面圖可以判斷出，最佳點均落在試驗考察的區域內。由圖5a可知，pH(A)與溫度(B)交互作用顯著(P=0.012 3＜0.001)且F值較大，因素作用效果明顯;由圖5b可知，pH(A)與NaCl濃度(C)交互作用極顯著(P=0.000 2＜0.001)且F值為3因素交互作用中最大(F=47.91)，因素相互作用效果極為明顯;由圖5c可知，溫度(B)與NaCl濃度(C)交互作用較為顯著(0.01＜P=0.044 6＜0.05)，因素作用效果相對另2組較差，但仍處于合理范圍之內;綜合以上結論并由曲面的彎曲程度和等高線可以看出，響應值的變化相當復雜，各個具體的試驗因素對響應值的影響并不是簡單的線性關系，而是二次關系。模型優化的產酶發酵條件為:pH 6.822、溫度 41.25℃、NaCl濃度為1.032%。預測值酶活為 24.279U/mg，期望值為97.8%。為操作方便，模型驗證時試驗條件設為pH6.8、溫度41℃、NaCl濃度為1%。結果表明，此條件下測得的氨肽酶酶活為23.85U/mg，與模型估計值24.279U/mg相比，相對誤差為0.02(＜0.05)，與預測值相比沒有顯著性差異，說明采用該響應曲面法優化得到的發酵條件參數準確可靠，利用本試驗建立的模型在實踐中進行預測是可行的。

3 結語

腐生葡萄球菌RG-2具有較強的耐亞硝酸鹽特性，當亞硝酸鹽濃度低于0.015%時，菌株生長繁殖及產酶無顯著變化，當亞硝酸鹽濃度達到0.03%時菌濃度仍能達到空白組的60%，產酶能力及酶活能達到空白組的67%。單因素試驗表明:該菌株最適生長繁殖及產氨肽酶pH范圍較廣(pH6.0～7.2);最適產酶溫度為40℃左右，而最適生長溫度則為45℃左右;當NaCl濃度大于3.5%時，菌株RG-2的產酶能力及生長繁殖均受到較強抑制。菌株產氨肽酶的最佳發酵條件為:pH6.8、溫度41℃、NaCl濃度為1%。此時，菌株產氨肽酶能力最高，達到23.85U/mg，為預測值的98%，模型驗證試驗表明此模型具有較好的預測能力。

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