高強脈沖電場強化甘氨酸銅螯合反應*

于倩，曾新安

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510641)

銅是動物和人體必需的微量元素之一，在機體的組成和代謝中起著很重要的作用［1］。一方面，它是肌體中很多金屬酶的組成成分，另一方面也是一些蛋白的輔基，對某些蛋白質的合成有促進作用［2］。與無機銅鹽相比，氨基酸銅作為第三代銅補充劑具有獨特的優勢，可以緩解礦物之間的拮抗作用，而且穩定性好，生物學效價高［3］，易吸收，因此近年來受到了廣泛的關注。目前氨基酸和銅的螯合反應主要采用液相反應，存在反應時間長，效率低的缺點［4］。因此，尋找一種更為高效的合成方法有重要意義。

脈沖電場(pulsed electric fields，PEF)是一種新興的非熱殺菌手段，在保證良好的殺菌效果的同時，對食品的色澤、口感以及營養物質保存較好，成為近年來食品生物領域的研究熱點［5－8］，脈沖電場對美拉德反應有一定的促進作用［9－11］，脈沖電場可顯著促進酯化反應，降低其活化能［12－13］。但是，關于PEF處理對螯合反應的影響還未見報道。本文以甘氨酸和硫酸銅為研究對象，研究PEF對該螯合反應的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料:甘氨酸(分析純，博奧生物有限公司，上海)、CuSO4·5H2O(分析純，啟輪化學科技有限公司，天津)、甘氨酸銅(分析純，恒綠源科技有限公司，湖北)、強酸性苯乙烯陽離子交換樹脂(ZG107，爭光樹脂有限公司，杭州)。

1.2 儀器與設備

脈沖電場設備為自主開發(專利號:02152160)，由高壓脈沖發生器，蠕動泵，處理室和示波器4個部分組成，產生的波為方形波，脈寬為40 μs，頻率1 kHz，場強為0～50 kV/cm。其他儀器包括恒溫水浴鍋(HH-501型，普天儀器制造有限公司，常州);pH計(PF20型，梅特勒托利多公司，瑞士);紫外-可見分光光度計(UV-1800型，島津公司，日本);傅里葉變換紅外光譜儀(Vector 33型，Bruker公司，德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 產物的鑒定

二硫腙顯色法:分別吸取硫酸銅溶液、反應液(螯合原液)和經過陽離子交換樹脂處理后的反應液(主要為螯合態銅離子)，加入雙硫腙顯色劑，搖勻，靜置幾分鐘，觀察顏色的變化［14］。

紫外光譜法:將配制好的硫酸銅溶液以及螯合反應的反應液分別用紫外分光光度計進行掃描，觀察其紫外吸收曲線。波長掃描范圍為190～300 nm，用蒸餾水調零［15］。

1.3.2 常規加熱條件下螯合反應最佳條件的確立

將相同濃度的硫酸銅和甘氨酸溶液混合，調節pH值后置于恒溫水浴鍋中反應，每隔10 min取樣，冰浴。用紫外-可見分光光度計測定最大吸收波長下的吸光度，計算產物的生成量。分別考察氨基酸和硫酸銅體積比(螯合比)、溶液pH值、反應溫度對單位時間內甘氨酸銅生成量的影響，確定反應條件［16］。

1.3.3 PEF作用下甘氨酸和硫酸銅的反應

在1.3.2中的最優條件下，用恒流泵使樣品以50 mL/min通過脈沖電場，處理場強分別10，20，30，40 kV/cm。用示波器監測脈沖電場的波形、場強以及頻率。使用水浴鍋控溫，處理前后維持在50℃左右。在處理室的出口和入口處，用帶探頭的數顯溫度計監控溫度變化，整個過程溫度波動在2～3℃。每隔10 min取樣，測定氨基酸銅含量，方法同1.3.2。

1.3.3 紅外光譜掃描

采用KBr壓片法，分別將少量樣品充分研磨后加入干燥的KBr，在紅外燈的照射下使其充分混合、壓片，置于紅外光譜儀內進行掃描，掃描范圍400～4 000 nm。

2 結果與分析

2.1 產物鑒定

2.1.1 二硫腙顯色結果

由于二硫腙的N原子可提供1個弧電子與金屬離子配位，生成易溶于三氯甲烷或四氯化碳的紅色絡合物［16］，可根據鰲合原液的顏色變化對螯合產物進行初步的判斷。當向硫酸銅溶液、螯合原液以及樹脂處理后的反應液中分別加入雙硫腙試劑后，其顯色分別為大紅色、橙紅色以及粉紅色。這說明反應后大部分銅離子是以螯合態存在，經過陽離子交換樹脂處理后，溶液中的銅幾乎都以螯合態存在。

2.1.2 紫外掃描結果

Cu2+在紫外區有較強的吸收，而甘氨酸在紫外區吸收很弱。配制一定濃度的硫酸銅溶液進行掃描，其最大吸收峰在203 nm左右。而硫酸銅和甘氨酸反應液的最大吸收峰在228 nm左右，與Cu2+相比有25 nm的紅移，說明溶液中的Cu2+和甘氨酸形成了穩定的配合物。杜俊等用Cu2+和各種氨基酸反應，用紫外掃描法也觀察到18～24 nm的紅移［17］。硫酸銅和甘氨酸銅的紫外掃描曲線見圖1。

圖1 硫酸銅和甘氨酸銅的紫外掃描曲線Fig.1 Ultraviolet scanning curve of copper sulfate and biscopper

2.2 螯合比對螯合反應的影響

金屬離子可以和多個氨基酸形成不同的配合物，按照一定的摩爾比結合［18］。螯合比的大小直接影響螯合產物的穩定性，也影響產物的生成量。由圖2可知，在相同時間內，隨著氨基酸和硫酸銅螯合比的增大，生成的產物量逐漸增大。當螯合比超過2∶1時，產量大幅度降低。當螯合為0.5∶1和3∶1時，產物的最大吸收峰在210 nm左右，與甘氨酸銅標準品相差甚遠。通常認為，氨基酸與金屬離子配位數1∶1時形成的具有電荷的絡合物，易被膠體吸附固定［18］，而當形成2∶1的內絡鹽時，電荷趨于中性，螯合環較為穩定，且易被植物吸收利用。因此，選擇2∶1為最佳螯合比。

圖2 不同螯合比下甘氨酸銅的生成量Fig.2 Biscopper content under different Chelation rate

2.3 pH值對螯合反應的影響

螯合反應受pH值影響很大，pH值太低，溶液中過多的氫離子會與銅離子競爭，影響螯合反應的進行;pH值太高，銅離子會轉化成氫氧化銅，阻礙反應的進行。由圖3可以看出，隨著pH值的增大，單位時間內甘氨酸銅的產量有所提高。當pH值達到8的時候，吸光值有所增大，但是溶液已經呈堿性，有文獻表明，堿性條件下銅離子和氨基酸會發生Biuret反應，生成另一種螯合物［19］。為了防止發生Biuret反應生成不需要的產物，選擇pH值為7進行研究。

圖3 不同pH下甘氨酸銅的生成量Fig.3 Biscopper content under different pH value

2.4 溫度對螯合反應的影響

溫度是影響反應速率的重要因素，增大溫度可以增加反應物分子間的碰撞速率，從而提高反應速度。紫外掃描光譜顯示，溫度對產物最大吸收波長的位置影響不大，均在228 nm左右。從圖4可以看出，隨著反應溫度的增大，單位時間內生成的甘氨酸銅持續增多，當溫度從50℃升高到60℃時，甘氨酸銅生成量變化減緩。因此，從節能的角度考慮，選擇50℃進行研究。

圖4 不同反應溫度下甘氨酸銅的生成量Fig.4 Biscopper content under different temperature

2.5 PEF處理對螯合反應的影響

在螯合比為2∶1，pH為7.0，溫度為50℃的反應條件下，用不同場強的脈沖電場處理反應液，對產物進行紫外光譜掃描，其最大吸收波長仍然是在228 nm左右。由圖5可以看出，20 kV/cm的場強處理20 min后，甘氨酸銅產量明顯高于未經電場處理的樣品。隨著電場強度的增大，促進效果增強。當場強達到40 kV/cm，處理時間為50 min時，甘氨酸銅的濃度提高了89%。在整個PEF處理過程中，溫度始終通過水浴維持在50℃左右，為了區分熱效應和PEF作用，將甘氨酸和硫酸銅混合后分別設在50℃和55℃反應，對比甘氨酸銅產量，結果顯示5℃溫升對反應影響不大，而本實驗中溫升不超過3℃，由此可以推斷，PEF處理的強化作用主要是非熱效應。

氨基酸水溶液在光或超聲波等外界條件影響下，共價鍵會發生均裂，形成自由基等不成對電子的原子團。這些自由基大都不穩定，不能單獨存在，傾向于互相結合，或者與其他物質的離子、自由基反應形成新的更穩定的分子［20］。甘氨酸分子一側有一個氨基，另一側有一個羧基，在pH值為7的中性條件下，沒有H+干擾，兩側的羧基和氨基在不同位置與金屬離子絡合，形成了螯合物甘氨酸銅。PEF是一種高強度的電場，能瞬時產生高強度電壓，有研究表明，PEF處理的油酸中產生了O－2·，從而促使油酸發生氧化為自由基鏈式反應［21］。當其作用于氨基酸時，可能促使氨基酸產生自由基，從而使氨基酸分子自由基與銅離子迅速螯合，從而加快螯合反應速率。

2.6 紅外光譜分析

圖5 不同PEF場強處理對甘氨酸銅產量的影響Fig.5 Bicopper content under different PEF intensity

對比許良忠［21］等人做的甘氨酸紅外圖譜和本研究。2種反應產物的紅外圖譜(圖6)可以看出，pH值為7的條件下，甘氨酸的IR光譜和本實驗螯合產物的紅外光譜具有明顯的差異，主要的吸收峰的位移及強度均發生了變化，說明硫酸銅和甘氨酸的確發生了配位反應。由圖中可以看出，υ(NH3+)的吸收帶均從3 170 cm－1發生了轉移，在3 263 cm－1左右和3 335 cm－1左右出現了υas(NH2)、υs(NH2)吸收峰，說明甘氨酸中的氨基參與了配位反應，形成了相應的甘氨酸配合物［22］。

圖6 甘氨酸銅的紅外吸收圖譜Fig.6 Infrared spectrogram of biscopper

表1 不同處理條件下的甘氨酸銅譜帶分布Table 1 The assignmemt of the vibrational spectrum of different biscoppers

羧酸成鹽后的非對稱與對稱伸縮振動的頻率之差△υ可以用來來衡量金屬與氧M-O形成價鍵的共價程度?！鳓栽酱?，表明金屬原子和氧原子共價程度越大，M-O的配位鍵越牢固［23］。由表1的數據可以算出，經PEF處理前后的甘氨酸銅△υ值分別為208 cm－1和216 cm－1，說明經PEF處理后，甘氨酸銅中的銅原子與氧原子共價程度更深，配位鍵更牢，從而證明螯合產物的穩定性得到了提高。

3 結論

本文研究了高壓脈沖電場對硫酸銅和甘氨酸的螯合反應的影響。結果表明，在螯合比2∶1、反應pH 7.0，反應溫度50℃條件下，PEF顯著促進了該反應的進行，隨著場強的增加，促進效果越明顯，且生成產物更為穩定。

［1］李青仁，王月梅.微量元素銅與人體健康［J］.微量元素與健康研究，2007，24(3):61－63.

［2］Colin F Mills，Ian Bremner，Ciba Foundation，et al.Biological roles of copper［M］.Excerpta Medica，1980:71－85.

［3］吳信，印遇龍，邢芳芳，等.國內外微量元素氨基酸螯合物的應用研究進展［J］.營養與飼料，2008(3):68－72.

［4］黃雪，廖列文，馮光炷，等.氨基酸微量元素螯合物合成方法研究進展［J］.安徽農業科學，2010，38(11):6 053－6 054.

［5］張艷，王圣開，崔俊林.PEF在食品加工中的應用［J］.農產品加工，2012(9):154－157.

［6］陶曉赟，王寅，陳健.高壓脈沖電場對藍莓汁殺菌效果及品質的影響［J］.2012，38(7):94－97.

［7］鐘葵，胡小松，陳芳，等.脈沖電場對果膠酯酶的活性及構象的影響［J］.2005，21(2):149－152.

［8］李迎秋，陳正行.高壓脈沖電場對大豆分離蛋白功能性質的影響［J］.農業工程學報，2006，22(8):194－198.

［9］Guan Y G，Hua L，Han Z，et al.，Effects of pulsed electric field treatment on a bovine serum albumin－dextran model system，a means of promoting the Maillard reaction［J］.Food Chemistry，2010，123(2):275－280.

［10］Wang J，Guan Y G，Yu S J，et al.，Study on the Maillard reaction enhanced by pulsed electric field in a glycin－glucose model system［J］.Food and Bioprocess Technology，2011，4(3):469－474.

［11］Guan Y G，Wang J，Yu S J，et al.，A pulsed electric field procedure for promoting Maillard reaction in an asparagine－glucose model system［J］.International Journal of Food Science＆ Technology，2010，45(6):1 303－1 309.

［12］曾新安，劉新雨.脈沖電場對乳酸乙醇酯化反應的影響［J］.華南理工大學學報，2011，39(12):127－13.

［13］Lin Z R，Zeng X A，Yu S J，et al.Enhancement of ethanol－acetic acid esterification under room temperature and non-catalytic condition via pulsed electric field application［J］.Food and Bioprocess Technology，2012，5(7):2 637－2 645.

［14］吳茹怡，曾里，曾凡駿.復合氨基酸螯合物鑒定方法的研究［J］.食品科技，2006(3):104－107.

［15］杜俊，高峰，陶海升，等.光度法測定Cu(Ⅱ)－氨基酸配合物組成［J］.安徽師范大學學報，2003，26(3):256－258.

［16］舒緒剛，李大光，林娜妹，等.一種測定氨基酸微量元素螯合物螯合率的檢測方法［P］:CN200810198628.1.2009－02－18.

［17］石銳，刁新平，辛延釗.微量元素-氨基酸螯合物的研究及應用［J］.飼料博覽，2000，6:15－17.

［18］滕冰，舒緒剛.關于微量元素氨基酸螯合物的幾個問題［C］.珠海:飼料營養研究進展——第五屆全國飼料營養學術研討會，2006－10－11～13.

［19］張小燕，杜建強，李亞萍，等.復合氨基酸螯合銅的制備工藝研究［J］.西北大學學報，2002，32(1):156－161.

［20］甘林火，翁連進，鄧愛華.制備氨基酸螯合鈣的研究進展［J］.氨基酸和生物資源，2008，30(1):44－46.

［21］梁琦，楊瑞金.高壓脈沖電場對乳狀液體系中油酸氧化的影響［D］.無錫:江南大學，2009:19－20.

［21］許良忠，文麗榮.過渡金屬－甘氨酸配合物的IR光譜［J］.光譜實驗室，2002，19(5):641－643.

［22］李德廣，杜相革.甘氨酸螯合銅的合成及表征研究［J］.安徽農業科學，2009，37(5):1 897－1 898.

［23］Nakamoto K.Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds［M］.New York，Academic Press，1978:62－67.