虎奶菇產纖維素酶條件優化的研究

黃碧芳，付劍杰，林文雄

(福建農林大學，福建 福州 350002)

目前草本生物質能源數量巨大，但工農業中草本資源的利用率很低，主要由于其自身組成復雜，特別是纖維素的結晶度、聚合度以及環繞著纖維素與半纖維素締合的木質素鞘，木質素與半纖維素以共價鍵形式結合，將纖維素分子包埋在其中，導致它的難降解性。菌草是經過科學實驗證明適合用于栽培食 (藥)用菌的草本植物，包括芒萁、五節芒、象草等草本植物，也包括作物秸稈。食用菌能以菌草為原料，生長獲得可食用菌體，可見食用菌能夠有效分解并利用菌草資源。而利用微生物產生的纖維素酶降解纖維素也是當前生物質能源的研究熱點之一。本實驗前期已采用剛果紅鑒別培養基即酶活測定，從18種食用菌中篩選出虎奶菇。本實驗嘗試以食 (藥)用真菌虎奶菇作為出發菌株，以菌草為碳源發酵產纖維素酶，研究產酶條件，為能源草資源能開發利用提供更全面的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

虎奶菇Pleurotus tuber-regium(Fr.)Singer，Pl0001來自福建農林大學菌物研究中心。

1.1.2 培養基

斜面培養基 (PDA)[1]:活化、保藏菌種;液體培養基(GPY)[2，3];

發酵產酶培養基:菌草5 g、營養液 〔(NH4)2SO40.2%、MgSO40.05%、KH2PO40.01%、蛋白胨 0.2%、酵母粉0.2%〕，pH自然。

1.2 酶活測定方法

采用3，5－二硝基水楊酸比色定糖法 (DNS)[4，5]測定酶的活力。

1.2.1 CMC酶活的測定

酶活的定義:1 mL酶液于上述條件下，1 min內產生1 μmol葡萄糖量的酶量定義為 1 個酶活力單位 “IU”[6－9]。CMC酶活力E(U·mL－1)公式為:

式中:x為回歸方程所測得的還原糖量 (mg·mL－1);n為反應體系的稀釋倍數;180為葡萄糖的相對分子質量 (g·mol－1);30為酶液的反應時間 (min)。

1.2.2 濾紙酶活 (FPA)的測定

酶活的定義:1 mL酶液于上述條件下，1 min內產生1 μmol葡萄糖量的酶量定義為 1個酶活力單位 “IU”[10－13]。FPA酶活力F(U·mL－1)公式為:

式中:x為回歸方程所測得的還原糖量 (mg·mL－1);n為反應體系的稀釋倍數;180為葡萄糖的相對分子質量 (g·mol－1);60為酶液的反應時間 (min)。

1.3 產酶條件優化

將半試管保存菌株接入裝有100 mL GPY培養液中，150 r·min－1，30℃下振蕩培養3 d，作為種子液。

1.3.1 不同轉速對菌株產酶的影響

以5%接種量接種至100 mL液體發酵產酶培養基內，分別以 120 r·min－1、150 r·min－1、180 r·min－1、210 r·min－1培養4 d，測酶活。

1.3.2 不同培養溫度對菌株產酶的影響

同上接種，分別置于25℃、30℃、35℃、40℃的恒溫搖床振蕩培養4 d，測酶活。

1.3.3 不同培養時間對菌株產酶的影響

同上接種，置于搖床分別培養4 d、5 d、6 d、7 d后測定酶活。

1.3.4 不同裝樣量對菌株產酶的影響

250 mL三角瓶分別裝入50 mL、75 mL、100 mL、125 mL發酵培養基，并置于搖床中發酵培養，測酶活。

1.3.5 不同接種量對菌株產酶的影響

100 mL發酵培養基中分別接入種子培養液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL搖床發酵，測酶活。

1.3.6 初始pH對菌株產酶的影響

調整發酵培養基初始 pH為5.8，6.4，7.0，7.5，再接入種子液置于搖床培養，測酶活。

1.3.7 不同氮源對菌株產酶的影響

分別以酵母膏、蛋白胨、尿素、KNO3、NH4Cl和(NH4)2SO4(濃度均為0.5%)作為氮源，在優化的發酵條件下進行產酶試驗，測酶活。

1.3.8 不同的常規碳源對菌株產酶的影響

分別以CMC、可溶性淀粉和蔗糖作為碳源在優化的條件下進行產酶試驗，測酶活。

1.3.9 不同的菌草碳源對菌株產酶的影響

分別以象草、巨菌草、五節芒、香根草、斑茅作為優化后發酵培養基碳源，搖床培養，測酶活。

1.3.10 菌草的不同添加量對菌株產酶的影響

1.3.9中得到的最適菌草碳源，按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%添加量作為碳源進行產酶試驗，測酶活。

2 結果與分析

2.1 不同轉速對菌株產酶的影響

不同轉速對菌株產酶的影響見圖1。

由圖1數據顯示，隨著搖床轉速的提高，虎奶菇產酶的CMC酶活有一定的提高，FPA酶活提高不大，這是液體培養基中的溶氧量增加的緣故。但轉速超過150 r·min－1后，菌株產酶的CMC和FPA酶活明顯下降，可能是轉速過高，造成機械損傷，影響了菌絲體的生長。

菌株在生長和產酶過程中要消耗氧氣，所以在產酶過程中應保持振蕩來增加發酵液的溶氧濃度，而且振蕩還可以讓菌體與發酵液中的營養物質充分接觸，使菌體獲得充足的營養成分。一般而言，搖床轉速的不同可能會影響到通氣量、營養代謝物和產物等的流動速度，進而影響到菌株的生長和產酶效果。轉速太低可能導致培養基中溶氧不足，影響菌體生長，進而影響產酶;轉速太高可能機械剪切力過大，造成菌絲斷裂過度，破壞菌體與營養成分的粘附，也影響產酶效果[15]。

2.2 不同培養溫度對菌株產酶效果的影響

不同培養溫度對菌株產酶效果的影響見圖2。

如圖2所示，隨著溫度的提高虎奶菇產酶量明顯上升，在30℃時，CMC酶活和FPA酶活均達到最高，其后隨溫度的升高而降低，且降幅巨大，說明虎奶菇對溫度很敏感。

溫度是影響細胞生長和發酵產酶的重要因素之一，虎奶菇細胞生長的最適溫度是28℃～32℃，與產酶最適溫度吻合，有利于對發酵產酶條件的控制。當溫度低于虎奶菇生長的最適溫度時，使其細胞內的酶代謝處于惰性狀態，進而影響虎奶菇的能量和合成代謝，使纖維素酶的分泌減少。當溫度高于虎奶菇生長的最適溫度時，會使其細胞內的酶代謝受到高溫的抑制，同樣不利于纖維素酶的分泌[15]。

2.3 不同培養時間對菌株產酶效果的影響

不同培養時間對菌株產酶效果的影響見圖3。

由圖3可知，纖維素酶酶活力隨著培養時間的延長呈現先上升后下降的趨勢。在發酵第4天時，酶活水平還相對較低，培養第5天時，菌體產酶水平大幅度提高，并且CMC酶活達到最大。在之后的培養時間里CMC酶活隨培養時間的延長而降低。FPA酶活卻在第7天達到所測的最大值。但FPA酶活所增加的幅度遠小于CMC酶活所降低的幅度，所以綜合2種酶活結果，選擇第5天進行虎奶菇的酶活測定。

虎奶菇液體發酵時菌絲體收集的最佳時間是在6 d～10 d，由此可知在此之前虎奶菇的菌絲體是處于迅速生長的狀態，需要大量的碳源和能源供應，這些都需要CMC的分解來提供。所以在這段時間適于測定纖維素酶產量及其酶活力。

2.4 不同裝樣量對菌株產酶效果的影響

不同裝樣量對菌株產酶效果的影響見圖4。

由圖4可知，培養液的裝樣量對虎奶菇的發酵產酶的影響不大。在一定范圍內，不同的裝樣量會通過影響通氣量、發酵過程中的營養代謝物總量和產物濃度的阻遏效應等一系列因素來造成不同的產酶效果，這是綜合因素導致的結果[16]。隨著培養基裝量的減少，溶氧量相對提高，促進菌體生長，提高纖維素酶的產量。但裝樣量的減少會增大機械剪切力，造成菌絲斷裂過度，破壞菌體與營養成分的粘附，影響產酶效果。同時培養基裝樣量的減少也會造成菌株在生長時營養元素的不足，尤其是在發酵后期。這些應該就是造成50 mL和75 mL的裝樣量的酶活小于100 mL裝樣量的原因。本實驗采用的三角瓶容量是250 mL，裝樣量為125 mL已經達到了容量的一半，不利于搖瓶培養，并且在100 mL裝樣量時虎奶菇有最高的CMC酶活，所以選擇100 mL作為最佳裝樣量。

2.5 不同接種量對菌株產酶效果的影響

不同接種量對菌株產酶效果的影響見圖5。

由圖5知接種量為5 mL和7 mL時酶活基本相同。因此從節約和降低污染的角度考慮，選擇最佳接種量為5 mL。1 mL時，由于接種量過少會導致菌體生長繁殖過慢，產酶活性降低，進而在發酵液中纖維素酶數量較少，導致酶活力較低。

2.6 初始pH對菌株產酶效果的影響

初始pH對菌株產酶效果的影響見圖6。

由圖6可知，虎奶菇在培養基隨著初始pH值的升高，纖維素酶活呈現上升趨勢。當初始pH值達6.4左右時，纖維素酶活力最大。在研究的范圍內，確定產酶最適pH為6.4左右，pH過大或過小都會影響纖維素酶的發酵。

2.7 不同氮源對菌株產酶效果的影響

不同氮源對菌株產酶效果的影響見圖7。

由圖7可知有機氮源對虎奶菇的產酶有較大的影響，蛋白胨和酵母膏作為氮源其酶活遠高于無機氮源的硝酸鉀、硝酸銨等。說明有機氮源可促進虎奶菇對纖維素酶的合成。在有機氮源中酵母膏是最適合虎奶菇生長所需，酶活最高。

2.8 不同的常規碳源對菌株產酶效果的影響

不同的常規碳源對菌株產酶效果的影響見圖8。

如圖8所示，虎奶菇對3種常規碳源的利用率從高到低分別是可溶性淀粉、CMC、蔗糖。說明菌株在簡單碳源和復雜碳源的存在下都可以生長和產酶，不需要專門的誘導物也可以合成少量組成型的纖維素酶。

2.9 不同的菌草碳源對菌株產酶效果的影響

不同的菌草碳源對菌株產酶效果的影響見圖9。

本實驗選用菌草研究中心推廣種植的5種菌草研究對菌株虎奶菇產酶的影響。由圖9可知，其產酶能力有明顯差異，對象草的利用最高，說明象草可為產酶提供必要的營養因子，誘導虎奶菇產纖維素酶，提高發酵效率;同時與常規碳源 (圖8)相比象草更能夠促進纖維素酶的產生。因此蔗糖等具有高度單一結晶結構的碳源產酶效果不佳，產酶能力最差，CMC－Na等半合成纖維素衍生物碳源效果次之，而天然纖維素底物做為碳源產酶能力最高。說明虎奶菇更適合用天然纖維素做碳源。

2.10 菌草的不同添加量對菌株產酶效果的影響

菌草的不同添加量對菌株產酶效果的影響見圖10。

由圖10可知，在前期酶活隨象草添加量的增加而提高，在1%～2%時呈基本穩定狀態，但隨著象草添加量的繼續增加，虎奶菇的纖維素酶活卻呈下降趨勢。說明含量在1%～2%的象草能夠滿足虎奶菇生長和進行酶的合成，并且象草本身所含的化學物質對虎奶菇的產酶促進作用遠遠大于其抑制作用。

3 討論

本實驗選用食用菌作為研究對象，由于食用菌栽培過程就以菌草為培養基，說明食用菌能夠較好的利用菌草這一可再生資源，這也就限定了選菌的范圍，造成了篩選出來的菌種在經過產酶條件優化后雖然擁有較高的菌草碳源的利用率但酶活力卻較低的結果，因此提高酶活將是今后研究降解菌草的中心。如本實驗中所用酶液為未經提純的初酶液，后期實驗可進行提純處理，以提高酶活等。草本生物質能源數量巨大，但利用率低，我們正努力嘗試，為其變廢為寶提供科學依據。

[1]胡開輝.微生物學實驗[M].北京:中國林業出版社，2004.

[2]Bifang Huang，Wenxiong Lin，Peter CK Cheung，et al.Differential proteomic analysis of temperature－induced autolysis in mycelium of Pleurotus tuber-regium [J].Current Microbiology，2011，62(4):1160－1167.

[3]黃碧芳，朱鴻萍，李彩斌，等.虎奶菇菌絲體自溶蛋白質制備方法比較 [J].中國食用菌，2010，29(1):52－54.

[4]李日強，辛小蕓，劉繼青.天然秸稈纖維素分解菌的分離選育[J].上海環境科學，2002，21(1):8－11.

[5]張宇昊，王頡，張偉，等.一種改進的纖維素分解菌鑒別培養基[J].纖維素科學與技術，2004，12(1):33－36.

[6]謝占玲，吳潤.飼料纖維素酶的研究進展 [J].青?？萍?，2003，10(3):24－26.

[7]呂東海，周巖民，李如治.飼用纖維素酶應用研究 [J].中國飼料，2004(10):25－27.

[8]仁太明，劉昭壯.淺談飼用纖維索酶的生產與應用 [J].飼料工業，1995，16(3):1－3.

[9]Koo H.Cellulae treatment of cotton fabries [J].T.R.J.，1994，64(2):74.

[10]胡國全，鄧宇，徐恒，等.極端嗜熱厭氧纖維素菌的分離、鑒定、系統發育分析及其酶學性質的研究[J].應用于環境生物學報，2004，10(2):197－201.

[11]白洪志，楊謙，王希國，等.纖維素降解菌綠色木霉C－08的篩選及酶學特性研究 [J].安徽農業科學，2007，35(17):5033－5034.

[12]郝月，楊翔華，張晶，等.秸稈纖維素分解菌的分離篩選[J].中國農學通報，2005，21(7):58－60.

[13]包衎，王曉輝，張偉瓊，等.纖維素分解菌的選育及酶活測定[J].生物學雜志，2007，24(2):56－58.

[14]陳冠軍，杜宗軍，高培基.耐堿性真菌纖維素酶生產菌的篩選及酶學性質的初步研究[J].工業微生物，2000，30(4):23－26.

[15]周德慶.微生物學教程 (第三版)[M].北京:高等教育出版社，2011.

[16]陳守文.酶工程[M].北京:科學出版社，2008.