低強度激光和有氧運動對大鼠圍絕經期骨結構和骨代謝的影響

覃飛，張馨蕾，阮洋，劉云，肖萬方，張二磊，郝選明

（華南師范大學 體育科學學院，廣東 廣州 510006）

骨質疏松癥(Ostcoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨組織微觀結構破壞，導致以骨脆性增高和骨折危險性增加為特征的系統性、全身性骨骼疾病。國際骨質疏松基金會的統計數據顯示，骨質疏松癥目前危害著全球大約1/3的50歲以上女性和1/5的50歲以上男性，已成為一個全球性的公共衛生問題。女性骨質疏松癥多發于圍絕經期(絕經期前一年及后一年這一時間區間)。由于卵巢功能下降，雌激素減少，骨質丟失速度呈指數增加，每年可達1%~5%，尤其在絕經后3年內丟失最多，且主要影響松質骨(如脊柱、股骨遠端等)[1]。藥物防治會導致經濟負擔增加而且治療周期長，帶來的副作用往往不易為患者所接受。因此，利用非藥物手段治療和預防圍絕經期骨質疏松，探索安全、方便和經濟的治療方式具有十分重要的現實意義。

低強度激光(Low level laser，LLL)可產生某種類似超聲波、針灸等物理因子的生物刺激效應，且對生物組織不會造成不可逆性損傷。目前已有一些研究表明，低能量激光治療可以活化成骨細胞[2]，促進骨修復[3]。因此，本研究通過建立圍絕經期自然生長大鼠模型，試圖通過研究運動與低強度激光對圍絕經期大鼠骨密度、骨結構、骨生物力學性能和骨代謝的影響，探索防治絕經后骨質疏松更為安全有效的方法。

1 材料與方法

1.1 模型構建與分組

SPF級雌性SD大鼠(8周齡，體重(220±20) g，許可證號：SCXK(粵)2008-0020，廣州中醫藥大學實驗動物中心)30只。正常喂養12個月，每周監測體重及健康狀況，直至達到14月齡，體重(340±20) g，采取陰道脫落細胞涂片HE染色法連續觀察3個動情周期(15 d)，并通過尾部靜脈取血收集大鼠血清，檢測血清E2含量[4]。以陰道細胞學表現為動情周期紊亂、動情間期延長者及血清 E2含量顯著低于其年輕分泌水平者為圍絕經期大鼠模型建立成功。造模過程中2只死亡，4只未達到上述評價標準。將24只造模成功的大鼠，隨機分為模型對照組(C)、單純運動組(E)、激光治療組(L)，“運動＋激光”組(E＋L)，每組6只。

1.2 運動方案

造模成功后，運動組大鼠適應性訓練1周后，正式開始下坡跑臺運動訓練，速度15 m/min，跑道傾角－5°，隔天訓練一次，每次運動2組，每組15 min(組間休息5 min)，持續8周[5-6]。

1.3 低強度激光治療

參考Júlia S等治療方案，進行8周低強度激光治療(GaAlAs，激光波長810 nm，光斑直徑4 mm)，隔天照射大鼠雙側股骨頸前、后、內側、外側4個照射點(無麻醉，手握制動，照射光纖接觸皮膚)，每個照射點30 s (50 mW，11.94 J/cm)[7]。激光聯合運動干預組，激光治療后30 min進行跑臺運動。

1.4 主要儀器及試劑

雙能 X線骨密度測試儀(GE，美國，暨南大學附屬第一醫院核醫學科)；酶標儀(PE VICTOR3，美國)；LD-1型半導體激光治療儀(GaAlAs，激光波長810 nm，光斑直徑4 mm，廣州市激光技術應用研究所)；石蠟包埋機、脫水機、染色機、石蠟切片機(LEICA，德國)；顯微鏡(Olympus，日本)；生物復合材料試驗系統(MTS 858，MTS Systems Corporation，美國，南方醫科大學臨床解剖學研究所)；雌二醇(E2)ELISA試劑盒(越研生物，上海)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，STR-ACP)(南京建成)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)(南京建成)。

1.5 檢測指標及方法

1)雌激素水平測試。

將收集的全血室溫靜置后，3 000 r/m in離心20 min，分離血清，－80 ℃保存。采用ELISA法檢測血清E2含量。具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2)骨密度測量。

每只大鼠實驗干預前后接受兩次雙能X線全身骨密度掃描，運用乙醚麻醉大鼠使其保持不動，檢測完畢后，同一操作者使用小動物測量專用分析軟件畫出相應感興趣區(左右股骨)，最終得出全身、左右股骨骨密度。

3)骨形態結構觀察。

將剔除肌肉、筋膜的大鼠股骨快速稱重、測量后，放入質量分數為 10%中性甲醛溶液固定 24 h后置于EDTA脫鈣液中(每2 d換一次EDTA)，約5周完成脫鈣。隨后將標本流水沖洗，沿股骨長軸正中剖開，常規乙醇梯度脫水，石蠟包埋，平行股骨長軸連續切片(5 μm)，制作股骨頭、股骨頸和股骨干整體切片。HE染色，中性樹脂封片，鏡下觀察骨髓腔、骨小梁變化，顯微鏡每張切片中骨小梁隨機采集 10個視野，運用Imagepro plus軟件進行骨小梁面積定量分析。

4)三點彎曲試驗。

剔除大鼠股骨主要肌肉，滅菌，噴灑生理鹽水后以紗布包裹，裝入凍存管液氮保存待用。實驗前將標本室溫自然解凍，放在MTS 858生物復合材料試驗機上進行股骨三點彎曲實驗，所有數據均由機器自帶軟件自動記錄，加載速度 v=1 mm/min，最大加載位移Smax=3.5 mm，跨距25 mm。

5)骨代謝相關指標測試。

取出－80 ℃大鼠血清，嚴格按照試劑說明書檢測堿性磷酸酶(AKP，比色法)及抗酒石酸酸性磷酸酶(STR-ACP，比色法)。

1.6 數據統計學處理

所有數據用平均數士標準差(x±s)表示，用SPSS Statistics 17.0統計軟件進行統計處理；實驗前后比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著性水平取P<0.05。

2 結果及分析

2.1 大鼠血清E2質量濃度

模型對照組治療周期前后，血清 E2質量濃度顯著降低(P<0.01)，其余 3組(單純運動組、激光治療組、運動＋激光組)E2質量濃度顯著升高(P<0.01)，且運動、運動＋激光組升高幅度均大于激光治療組。治療結束后，激光治療組(P<0.05)、單純運動組(P<0.01)、運動＋激光組(P<0.01)血清E2含量均顯著高于安靜對照組(見表1)。

表1 各組大鼠干預前后血清E2質量濃度 ng/L

表1 各組大鼠干預前后血清E2質量濃度 ng/L

1)與干預后比較，P<0.01；2)與安靜組比較，P<0.05；3)與安靜組比較，P<0.01

組別 n/只 干預前 干預后對照組 6 1.083±0.0521) 0.962±0.060激光組 6 1.084±0.0901) 1.192±0.1102)運動組 6 1.079±0.0551) 1.317±0.0973)“運動+激光”組 6 1.077±0.1571) 1.342±0.1123)

2.2 大鼠骨密度測試

對照組干預前后股骨、全身 BMD均極顯著降低(P<0.01)，其余治療組(單純運動組、激光治療組、“運動＋激光”組)股骨、全身BMD均顯著升高(P<0.01)，其中運動組股骨BMD升高幅度最大，“運動＋激光”組全身 BMD升高幅度最大。干預治療結束后，運動組、“運動＋激光”治療組股骨BMD均顯著高于安靜對照組(P<0.01)、(P<0.05)。單純運動組、激光治療組、“運動＋激光”組全身BMD顯著升高(P<0.05)(見表2)。

表2 大鼠股骨及全身BMD g/cm2

表2 大鼠股骨及全身BMD g/cm2

1)與干預后比較，P<0.01；2)與安靜組比較，P<0.05；3)與安靜組比較，P<0.01

組別 n/只 干預前 干預后 干預前 干預后股骨BMD 全身BMD對照組 6 0.232±0.0071) 0.220±0.007 0.188±0.0081) 0.178±0.006激光組 6 0.227±0.0101) 0.237±0.009 0.186±0.0051) 0.194±0.0042)運動組 6 0.231±0.0041) 0.246±0.0063) 0.187±0.0061) 0.194±0.0072)“運動+激光”組 6 0.230±0.0071) 0.242±0.0092) 0.187±0.0081) 0.199±0.0072)

2.3 大鼠股骨HE染色組織學觀察

對照組(C組)骨小梁明顯減少、變細，部分小梁中斷且逐漸被吸收；拱橋形結構變薄、塌陷，骨小梁間隙明顯加寬，骨髓腔增大，出現大片無骨小梁骨髓區。骨小梁附近及表面可見破骨細胞增生活躍。其余3組：單純運動組(E組)、激光治療組(L組)、“運動＋激光”組(E＋L組)骨小梁較粗大，小梁連接點較多，可見拱橋形結構呈圓形、卵圓形或梭形緊密排列，可見較多的成骨細胞排列在骨小梁表面(見圖1)。運用IPP軟件分析骨小梁面積發現(見圖 2)：激光治療組(P<0.05）、單純運動組(P<0.01)、“運動＋激光”組(P<0.01)骨小梁面積均顯著高于對照組且“運動＋激光”組骨小梁面積顯著高于激光治療組(P<0.05)。

圖1 大鼠股骨組織形態學觀察

圖2 各組大鼠股骨骨小梁面積

2.4 大鼠股骨生物力學指標

如圖 3所示，激光治療組(L組)、單純運動組(E組)、“運動＋激光”組(“E＋L”組)與對照組(C 組)相比股骨最大載荷均增大，且運動＋激光組具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 各組大鼠股骨最大載荷變化量

2.5 大鼠血清STR-ACP及AKP酶活性

運動組(E組)血清AKP顯著高于(P<0.01)安靜對照組(C組)、激光治療組(L組)、運動+激光組(“E＋L”組)。3個干預組血清 STR-ACP均下降，但無顯著性差異(P>0.05)；運動組、“運動＋激光”組血清STR-ACP與AKP比值較之對照組極顯著降低(P<0.01)。

表3 各組大鼠血清中AKP、STR-ACP 酶活性

表3 各組大鼠血清中AKP、STR-ACP 酶活性

1)與對照組比較，P<0.01；2)與激光組比較，P<0.01；3)與運動組比較，P<0.01

組別 n/只 AKP活性/(U·L-1) STR-ACP/(U·L-1) STR-ACP活性/AKP活性對照組 6 102.46±16.14 4.72±0.59 0.046±0.0057激光組 6 105.53±14.07 4.24±0.60 0.040±0.0053運動組 6 141.66±8.991)2) 4.38±0.88 0.031±0.00861)“運動+激光”組 6 117.74±14.213) 3.95±0.77 0.034±0.00881)

3 討論

3.1 有氧運動及激光治療對大鼠骨密度的影響

骨礦密度(Bone mineral density，BMD)是骨礦代謝中骨的量化標準，是骨骼強度的重要指標之一。BMD對于早期診斷骨質疏松十分重要，當 BMD低于某一范圍時就會產生臨床上所表現的骨質疏松，骨折的危險性提高。大量臨床調查顯示，圍絕經期婦女 BMD呈指數下降，骨質疏松患病率呈高發趨勢。本實驗通過對各組圍絕經期大鼠施加8周的跑步運動和/或低強度激光照射干預前后進行全身骨密度追蹤測試，結果發現：單純運動組(E組)通過8周中等強度下坡跑后，股骨BMD與對照組(C組)相比極顯著提高(P<0.01)，增加效果優于激光治療組(L組)和“運動＋激光”組(“E＋L”組)，但全身骨密度提高幅度低于其他2種干預方式。動物跑臺運動主要為四肢運動，在應力作用下可促進礦物質在四肢的沉積，因此大鼠肢體的 BMD增加效果顯著，而軀干等其他部位所承受的應力較小，BMD沒呈現出大幅度增加。上述結果提示我們在運動過程中應兼顧不常鍛煉的部位，才能達到運動提高全身BMD的最佳效果。

激光治療組(L組)大鼠的股骨和全身BMD與干預前相比均顯著增加，且8周干預后全身BMD明顯高于對照組。其機制可能與低強度激光引發細胞低水平活性氧功能改變和成骨細胞的基因表達改變有關。有研究表明，活性氧可提高破骨細胞的活性，促進成骨細胞凋亡和直接參與骨有機質的降解[8]。Timon Liu[9]報道激光照射可調節細胞活性氧的水平和MAPK活性。這種在激光照射部位的各種細胞中產生的活性氧狀態改變，可能參與了本研究中圍絕經期大鼠的良好骨代謝效應機制。另外，有學者構建cDNA微點陣以鑒定低強度激光處理后成骨細胞的基因表達型，結果發現多個直接或間接的在提高細胞增殖和抑制細胞凋亡中起作用的基因上調，與抗氧化、能量代謝和呼吸鏈相關的基因上調[10]。這些發現為我們進一步研究低強度激光調節圍絕經期大鼠骨代謝中的機制指出方向。值得注意的是，激光治療組全身 BMD提高明顯，其效果與運動干預組、“運動＋激光”組沒有顯著性差異。提示我們局部激光照射可能通過促進全身體液循環，加速礦物質及其相關物質的代謝與吸收，或者同時通過其他機制促進礦物質在骨骼中的沉積。Hentschke VS[11]在研究中也提出通過局部的激光照射可達到身體其他部位的治療效應。這種激光產生的良好效應，可以用來治療和預防長期臥床和圍絕經期婦女的骨質疏松癥。本實驗組中“運動＋激光”組與干預前相比，股骨和全身BMD均顯著提高(P<0.05)，但3種干預方式(運動、激光、“激光＋運動”)對于股骨和全身骨密度的影響，并沒有呈現出顯著性的差異，說明運動和低強度激光干預均能顯著抑制圍絕經期女性的骨量大幅度丟失，但運動和低強度激光并沒有呈現明顯的疊加效應，其機制需要在進一步的研究中加以探討。

3.2 有氧運動及激光治療對大鼠骨結構、骨生物力學性能的影響

骨質由骨密質、骨松質和骨髓腔組成。骨密質在所有骨質外表面，由規則緊密排列的骨組織構成。骨松質由很多針狀或片狀的的骨小梁構成，骨小梁呈拱形結構排列是骨承重的重要保證。對骨結構來說，承受壓應力的能力最強，而承受剪應力和拉伸應力的能力較弱。骨小梁的拱結構恰好能使剪應力轉化為壓應力，使骨處于理想應力環境中[12]。本實驗通過股骨HE染色觀察各組形態學結構發現，圍絕經期大鼠股骨的主要變化為骨小梁結構及數目的變化。對照組(C組)骨小梁明顯減小并變細，部分小梁中斷且被吸收，拱橋形結構變薄、塌陷。骨小梁數目減少、質量下降將導致骨承重能力下降和脆性增加。骨小梁拱形結構的破壞說明骨無論是軸心受力還是偏心受力都容易發生“失穩”狀態，因而導致骨折危險度增加。本研究的干預療程結束后，運動、激光、“運動＋激光”3組大鼠的骨小梁數目、結構均有明顯改善，成骨細胞在骨小梁表面排列趨于緊密，其中以“運動＋激光”組(“E＋L”組)效果最佳。

骨生物力學特征直接反映骨的內在質量和性能，它與骨量、骨體積、皮質骨厚度和松質骨小梁結構數目有密切關系，是對骨形態結構的綜合反映[13]。其中最大載荷大小反映骨骼在外力負荷作用下的可塑性。本實驗各組大鼠股骨生物力學測試結果的比較表明，圍絕經期大鼠的骨拮抗變性和抗破壞能力下降，骨的硬度和韌性發生改變，是骨質疏松的表現。而3個干預組的股骨最大載荷均增大，其中“運動＋激光”組差異具有顯著性(P<0.05)。結合上述骨量和骨結構的統計結果，我們發現3組不同干預手段其骨量、骨結構和骨的力學性能變化并非完全同步。提示，骨量并不能完全反映骨的穩定性和強度，而骨性能好壞，應全面考慮各種因素。其中，骨的微結構(骨小梁拱形結構)、骨膠原纖維量及排列情況對于決定骨骼強度也起著重要的作用[14]。因此圍絕經期女性在預防和治療骨質疏松癥的過程中，應選擇多種有效的干預方式，全面提升自身骨骼的質量和性能。

3.3 有氧運動及激光治療對大鼠血清E2質量濃度及骨代謝指標的影響

性激素在圍絕經期骨質疏松癥發病機制中發揮重要作用。馮利等[15]研究表明：圍絕經期骨質疏松癥，是由于卵巢功能的衰退，導致神經-內分泌-免疫系統功能改變。其中，E2水平下降導致下丘腦垂體-性腺軸生殖內分泌紊亂是引起圍絕經期代謝變化和臨床病癥的主要原因。本實驗通過測試干預前后大鼠血清E2質量濃度發現，隨著圍絕經期進程的發展，安靜對照組E2水平逐漸下降(P<0.01)，而其他施加干預的3組，E2水平不同程度的增高，其中運動組和“運動＋激光”組升高效果優于激光組。卜淑敏等[16]的研究結果為解釋這一差別提供了一定的線索，缺乏運動可導致皮下脂肪或腹腔內脂肪中 17?-類固醇脫氫酶增加，進而增加睪酮含量，導致E2合成通路障礙。其他學者12個月的臨床隨機實驗亦表明，運動可以降低超重絕經后婦女循環血液中的睪酮水平，提高E2水平[17]。因此運動這一干預因素對提高圍絕經期女性E2質量濃度具有很好的作用。

骨形成的相對減弱和骨吸收的相對增強，即二者的偶聯障礙可導致骨質疏松的發生[18]。血清堿性磷酸酶(AKP)主要由肝臟和成骨細胞合成，對于肝功能正常的機體，血液中AKP升高主要是由代償性骨形成增強所引起，因此，血清AKP是最常用的評價骨形成和骨轉換的指標，是反映成骨細胞活躍程度的生物標志物之一[13]。抗酒石酸酸性磷酸酶(STR-ACP)在骨吸收時對骨基質的溶解起重要作用，可作為反映破骨細胞活性和骨吸收情況的重要指標。本研究結果顯示：運動組血清AKP顯著高于安靜對照組、激光治療組、“運動＋激光”組。運動組、“運動＋激光”組、激光組的血清STR-ACP較之對照組雖有所降低但無顯著性差異。運動組、“運動＋激光”組的STR-ACP與AKP比值極顯著低于安靜對照組(P<0.01)，提示運動組、“運動＋激光”組的骨代謝平衡呈現良好的轉變。以上研究結果說明，運動這一干預手段可有效促進骨形成過程，致使圍絕經期成骨與破骨之間的平衡發生有益的改變，有效預防和延緩骨質疏松的發生。同時，“運動＋激光”聯合干預亦可以有效改善圍絕經期成骨與破骨之間的平衡。而單純低強度激光干預后，大鼠血清AKP、STR-ACP及其比值與對照組相比雖有改善但無顯著性差異，這可能是由于治療周期短，未能達到理想的光應答效應。

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