DEHP對雄性小鼠生殖功能的影響

曲 莉,李善姬,徐 斌,白雪松

（1.北華大學公共衛生學院,吉林 吉林 132013;2.吉林醫藥學院公共衛生學院,吉林 吉林 132013）

鄰苯二甲酸酯類（phthalic acid esters.PAEs）是公認的環境內分泌干擾物,在PAEs類塑化劑中最常使用的是鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[Di-（2-ethylhexyl）phtha-late,DEHP],其產量占到鄰苯二甲酸酯類物質總產量的50%以上[1]。DEHP主要應用于各種塑料包裝用品,同時在涂料、印刷油墨、染料、農藥等工業生產中應用廣泛。DEHP以非共價鍵與聚氯乙烯等物質結合,在塑料產品使用過程中被釋放出來,形成環境污染物[2]。DEHP一般是通過污染的大氣、水體、土壤和食物等途徑進入人體[3],可對肝、腎、心、肺、生殖系統等臟器產生較大的毒性損害。環境內分泌干擾物可以影響到人體的內分泌進程[4],目前最為引人關注的是其所致生殖損傷,生殖系統作為DEHP毒性作用的主要靶器官,DEHP的雄性生殖毒性主要表現為生殖結構、睪丸組織以及生殖細胞的異常。本試驗以不同劑量DEHP對雄性小鼠進行染毒,觀察其對小鼠生殖功能的影響,為進一步研究DEHP生殖毒性提供相應的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只成年健康雄性小鼠,體重為25±2 g。由吉林醫藥學院動物實驗中心提供。飼養于溫度22℃ ±2℃,濕度50% ±5%。

1.2 試驗試劑與儀器 鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）（純度≥99.5%）,購自美國 Sigma公司;生理鹽水（吉林省都邦藥業股份有限公司）;吐溫80（上海盈公生物技術有限公司）;1%伊紅（武漢博士德生物工程有限公司）;甲醛（上海盛欣醫藥化工有限公司）;CX41正置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;DT1001電子稱（江蘇省常熟市意歐儀器儀表公司）;FA1104N分析天平（上海天平儀器廠）;HHS電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）;精子計數板（上海求精生化試劑儀器有限公司）;HC-1014離心機（北京京立離心機有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與處理 將40只成年健康雄性小鼠按體重隨機分成4組,分別為空白組（生理鹽水）和低（250 mg/kg·bw）、中（500 mg/kg·bw）、高（1 000 mg/kg·bw）劑量DEHP染毒組,每組10只。

DEHP染毒溶液配制方法:取純度99%的DEHP和吐溫80各15 mL到棕色試劑瓶里,以1∶1的體積比溶解,接著取118 mL的0.9%生理鹽水到棕色試劑瓶中,最后取0.6 mL的0.9%生理鹽水到棕色試劑瓶中,配置成濃度為1.0 mg/mL的溶液供高劑量組染毒使用。中、低劑量組用吐溫稀釋成相應濃度使用。

每天稱重,根據體重按灌胃體積（10 mL/kg）給予不同劑量DEHP和生理鹽水,每天一次,連續4周,試驗期間觀察動物的活動、毛發及進食情況。

1.3.2 睪丸、附睪重量及其臟器系數測定 處死小鼠前1 d禁食不禁水,稱量小鼠體重,脫臼處死小鼠,迅速取出雙側睪丸、附睪,并小心剝離周圍的結締組織和脂肪組織后稱重,計算其臟器系數（臟器系數=臟器重量/體重×100%）。

1.3.3 精子計數方法 將雙側附睪放在盛有2 mL生理鹽水的表面皿中,用眼科剪將附睪縱向剪2～3下,再用膠頭吸管將懸浮液輕輕吹打6～7次,靜置5 min,用4層擦鏡紙小心過濾,過濾掉組織碎片,制成精子懸液。吸取一滴精子懸液到精子計數板的兩個計數池內,靜置5 min,先將充好精子懸液的計數板小心放置在低倍鏡下,然后轉動粗準焦螺旋找到計數板中心方格,選擇精子分布比較均勻的計數池,然后轉換成高倍鏡觀察,在高倍鏡下數中間大方格內的5個中方格（4角4個和中間1個或對角線5個）,計數時要按一定的順序進行,以避免遺漏和重復,壓在雙線上的精子就只計兩邊,即只計上方和左側線上的精子,而壓在下方和右側線的精子均不計入（即計左不計右,計上不計下）。將5個中方格計數的精子數相加,記為n,以1 mL精子懸液中的精子數目作為精子總數（1 mL精子總數=n×50 000）。

1.3.4 精子畸形率測定 取精子懸液以3 000 r/min離心20 min,吸去離上清液,剩余的少量液體與沉淀搖勻后,取1滴懸液于載玻片一側,均勻涂片,晾干后甲醛固定5 min,晾干后用1%伊紅染液染色1 h,在高倍鏡下檢查精子形態,每只小鼠檢查結構完整的1 000個精子,并計算畸形率（%）。

1.4 數據處理 所有數據的均采用SPSS20.0軟件進行統計分析,數據均以平均值±標準誤差（mean±SE）表示,各實驗組差異檢驗采用單因素方差分析,方差齊時,各組間兩兩比較用LSD方法,不齊時,各組間兩兩比較采用Tamhane′s方法。

2 結果

2.1 一般情況 在染毒期間,各劑量DEHP染毒組與陰性對照組比較,小鼠出現活動減少、被毛蓬松等中毒癥狀,進食情況良好。

2.2 DEHP染毒對雄性小鼠睪丸、附睪重量及其臟器系數的影響 本次試驗結果顯示:與空白組比較,中、高劑量DEHP染毒組的小鼠的睪丸、附睪重量及其臟器系數均下降,低劑量DEHP染毒組僅睪丸重量明顯下降,差異均有統計學意義（P＜0.05）;隨著DEHP染毒劑量的升高,小鼠的睪丸、附睪重量及其臟器系數呈下降趨勢。結果見表1。

表1 DEHP染毒對小鼠睪丸、附睪重量及其臟器系數的影響

2.3 DEHP染毒對小鼠精子計數和精子畸形率的影響 本次試驗結果顯示,與空白組比較,各劑量組的小鼠精子計數明顯降低、精子畸形率明顯升高,差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著DEHP染毒劑量的升高,小鼠精子計數呈下降趨勢,精子畸形率呈上升趨勢。結果見表2。

表2 DEHP染毒對小鼠精子計數和畸形率的影響

3 討論

近年來DEHP對雄性生殖系統的毒性作用越來越受人們關注,雄性生殖系統是一個非常復雜的系統,包括睪丸、附睪、精囊、射精管、陰囊、輸精管等。雄性生殖系統中最重要的器官是睪丸,它主要發揮著生成精子、分泌和合成雄性激素的功能,在維持生育及性功能等方面具有非常重要的作用。臟器系數即臟器重量/動物體重,若受試物使某個臟器受到損害,如充血、增生、萎縮、水腫等,則該比值就會發生變化,可以減小或增大。所以臟器系數是一個靈敏和客觀的指標[5],它的變化可以比較全面的反映出毒性物質對該臟器的影響,與此同時還能為毒物作用于哪個靶器官提供重要依據。本次試驗結果顯示,雄性小鼠經DEHP染毒后,睪丸和附睪臟器系數有著不同程度的改變,隨著DEHP染毒劑量的升高,與空白組相比,睪丸和附睪臟器系數降低,表明DEHP對睪丸和附睪有毒性作用。本次試驗結果與丁承輝[6]報道的結果一致。

精子數量是維持雄性生育能力的主要條件,精子計數的改變在評價有害因素對精子生成的影響時比其他指標更為敏感,它是研究環境因素對雄性生殖健康影響的很重要的觀察終點,可反映其生精細胞的功能,是一種用于評價精子發生致毒效應的方法[7]。本研究發現各染毒組雄性小鼠精子計數均低于空白組,中、高劑量組小鼠精子計數與空白組比較顯著降低,說明DEHP對小鼠的精子生成有抑制作用,對各級精母細胞有明顯的毒性作用,干擾精子的生長發育過程。可能的原因是DEHP或其代謝產物直接作用于睪丸組織,一方面DEHP可能損害睪丸間質細胞,引起T分泌的減少,由于睪丸T水平的降低,必定會對支持細胞（Sertoli細胞）產生影響,包括影響它的分泌功能以及對生精細胞的營養和支持作用,另一方面破壞生精過程,使各級生精細胞數量減少,然后精子生成數量就減少,接著精曲小管管壁也變薄,甚至是精曲小管整體的橫徑變短,生精細胞變性、脫落進入管腔,最終可導致精子數量的減少。

小鼠精子畸形試驗是我國食品、藥品、化妝品等商品進行雄性生殖細胞遺傳毒性安全性評價的標準方法[8]。精子畸形試驗是評價毒物對雄性生殖毒性及潛在誘變性的一種快速便捷方法,能夠較為客觀地反映精子的形態發育情況。本試驗結果顯示,經DEHP染毒后,各劑量組小鼠精子畸形率明顯高于空白組,且隨著DEHP染毒劑量的增大精子畸形率隨之增高,說明一定濃度的DEHP可影響精子的生成和發育過程,導致精子畸形的發生,DEHP對雄性小鼠生殖細胞具有致畸作用,存在著一定的生殖毒性。本次結果與鄭立[9]和王蕊[10]的文獻報道基本一致。