生物組織光聲粘彈顯微成像＊

陳叢桂，趙 岳，楊思華

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)研究所、暨激光生命科學(xué)教育部重點實驗室，廣東廣州 510631)

0 引言

粘彈性是一個非常重要的物理特征參數(shù)，在描述物質(zhì)在熱力學(xué)和動力學(xué)的變化過程中都有重要的意義。在醫(yī)學(xué)上，組織粘彈性的變化往往與病理密切相關(guān)［1］。傳統(tǒng)的彈性成像方法僅用彈性這一參數(shù)來表征生物組織的力學(xué)特性，然而，絕大多數(shù)生物組織在力學(xué)特性上所表現(xiàn)出的復(fù)雜性并不是彈性模量這一項參數(shù)就可以完全表述的，在對它們粘彈性表征和流變學(xué)行為的描述中，粘滯性往往和彈性一樣重要，尤其是對于軟固體等生物組織，彈性不足以描述其完備的內(nèi)在特性，如軟骨、骨頭、肌腱和肌肉等，都需要用粘滯性和彈性兩者共同描述來表征特性的變化和醫(yī)學(xué)的檢測［2］。因此，能夠檢測組織粘彈性特征的檢測技術(shù)在醫(yī)學(xué)應(yīng)用和臨床研究上具有重要的意義。

光聲成像融合了純光學(xué)成像的高對比度和純聲學(xué)成像的高分辨率的優(yōu)點［3-7］，在過去的十年中，光聲成像在血氧飽和度的監(jiān)測，腦功能成像［8］和易損斑塊的檢測［9］等很多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域中已經(jīng)取得了很大的進展［10-13］。目前，常規(guī)光聲顯像依靠的是組織光吸收對比度，反映的是組織的光吸收系數(shù)，技術(shù)上主要是靠測量脈沖或強度調(diào)制的激光所激發(fā)出光聲信號的幅值來進行組織內(nèi)部光吸收分布的反演，并沒有考慮到光聲信號產(chǎn)生和傳播過程中的相位信息。實際上，如果以一定頻率的激光作用于組織，根據(jù)光聲效應(yīng)，組織就會形成熱膨脹振動，從而產(chǎn)生與激發(fā)光頻率一致的受迫超聲波(即光聲信號)，但由于組織粘彈性產(chǎn)生的阻尼效應(yīng)，調(diào)制激光(相當(dāng)于應(yīng)力)和超聲波(相當(dāng)于應(yīng)變)之間會產(chǎn)生一定的相位延時［14］。而不同粘彈性質(zhì)的組織或病理在相同的激發(fā)條件下將會產(chǎn)生不同的相位延時。因此，利用測量的相位延時大小作為成像對比度，所重建的圖像則可反映探測點粘彈性質(zhì)的強弱;比較組織不同探測點的相位延遲，結(jié)合一定的圖像信息處理方法，就能重建出反映組織內(nèi)部粘彈特性分布的粘彈圖像。為了得到更高的分辨率，可以把激光聚焦為點，用點光源來激發(fā)組織，產(chǎn)生聲信號，得到組織的光聲粘彈顯微圖像。

課題組在前期研究中基于熱粘彈性理論結(jié)合光聲效應(yīng)波動方程，推導(dǎo)出了軟固體相位延遲和粘彈性之間的關(guān)系。本文在此基礎(chǔ)之上，構(gòu)建出了高對比度高分辨率的光聲粘彈顯微系統(tǒng)，并用模擬樣品驗證了該顯微成像系統(tǒng)的可行性。

1 理論背景

一個強度調(diào)制的連續(xù)激光照射在吸收各向同性的粘彈組織上，入射光強為［14］:

其中，I0是衍射光強，ω是調(diào)制頻率。組織中的吸收體吸收光由于無輻射躍遷導(dǎo)致溫度以如下正弦形式發(fā)生變化:

其中，T0是初始溫度，根據(jù)熱彈性機制引起組織的熱膨脹和收縮產(chǎn)生光聲信號［15］。由于光強度的周期性變化，光聲波被周期性的激發(fā)并且其主頻率等于調(diào)制頻率，在上述過程中，局部的循環(huán)加熱引起熱應(yīng)力，由于壓力波形式的應(yīng)力產(chǎn)生應(yīng)變。因為生物組織粘彈性的阻尼效應(yīng)，應(yīng)變也周期性的交替變化，但是會有一個位相的延遲。考慮到光聲信號的產(chǎn)生過程，我們選擇流變學(xué)的

Kelvin-Voigt模型來表示具有粘彈特性的生物組織［16-17］，得到應(yīng)變響應(yīng)如下所示［18］:

其中，εA是動態(tài)復(fù)應(yīng)變幅值，E是楊氏模量，ω是調(diào)制頻率，η是粘度系數(shù)。由公式(3)，我們可以知道相位延遲δ和粘彈比η/E的關(guān)系:

2 實驗系統(tǒng)與方法

圖1 光聲粘彈顯微成像系統(tǒng)裝置的原理圖Fig.1 Scheme of experimental setup for photoacoustic and viscoelastic microscopy imaging system

實驗原理圖如圖1所示，采用波長為808 nm的連續(xù)光半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源，主頻為50 KHz，電光調(diào)制器的調(diào)制深度為90%，函數(shù)發(fā)生器產(chǎn)生的調(diào)制信號(50 KHz)經(jīng)放大器放大后用來提供調(diào)制器的調(diào)制電壓，通過調(diào)制器的連續(xù)激光被調(diào)制為強度變化，由4×顯微物鏡(NA=0.1)聚焦在生物樣品上，樣品制成0.3 mm厚的片，激光通過聚光物鏡在樣品表面的光斑大小約0.1 mm，在樣品表面上的激光功率密度被限制在200 mW/cm2以內(nèi)，樣品固定在二維電機移動平臺上，超聲換能器(主頻:50 KHz)固定在水槽底部，經(jīng)樣品后產(chǎn)生的光聲信號由超聲換能器接收，經(jīng)前置放大器放大后傳至鎖相放大器(SR830，美國斯坦福公司)，鎖相放大器作為相敏檢波器使用，調(diào)制信號的另一支作為參考信號輸入到鎖相放大器中，光聲信號和參考信號在鎖相放大器中進行相位比較解得兩路信號的相位延時。在數(shù)據(jù)采集過程中，樣品被放置在水槽中，并用蒸餾水進行聲耦合。由計算機控制電機的二維掃描并分析光聲信號的相位延遲，得到樣品的二維光聲粘彈顯微圖像。

3 結(jié)果

3.1 模擬樣品光聲粘彈成像

理論上，光聲信號和參考信號之間的相位差隨著樣品濃度的增加而減小。為了驗證系統(tǒng)光聲信號的相位延遲與組織粘彈性的關(guān)系，分別用濃度為1.2%、2.4%和3.6%的瓊脂樣品模擬具有不同粘彈性能的組織進行光聲粘彈顯微成像，每個樣品測得的相位延遲平均16次。實驗結(jié)果如圖2(a)所示，正如理論預(yù)期的，光聲信號和參考信號之間的相位差隨著樣品硬度的增加而減小。此外，為了驗證樣品的吸收系數(shù)對光聲信號相位延遲的影響，在同一濃度(2.4%)的瓊脂樣品中分別加入2%、4%和6%的黑墨水模擬具有不同吸收系數(shù)的組織。理論上，樣品的吸收系數(shù)只影響光聲信號的強度，而不影響光聲信號和參考信號之間的相位差。正如圖2(b)結(jié)果所示，濃度相同、吸收系數(shù)不同的樣品測得的光聲信號與參考信號之間的相位延遲幾乎相同，而光聲信號的強度隨著吸收系數(shù)的增大而增大，說明組織的吸收系數(shù)可以影響光聲信號的強度，但對光聲信號的相位延遲影響不大。

圖2 (a)不同濃度瓊脂樣品的光聲信號的相位延遲(b)同一濃度不同吸收系數(shù)的瓊脂樣品的光聲信號的強度和相位延遲Fig.2 (a)The phase delay obtained by PA measurement from agars with different concentrations.(b)The phase delay and PA intensity of the agar phantoms with same concentrations but different proportions of ink

3.2 系統(tǒng)分辨率測試

為了測試系統(tǒng)的分辨率，實驗用直徑約為60μm左右的頭發(fā)絲埋于瓊脂中進行光聲粘彈顯微成像，樣品如圖3(a)所示，其中紅虛線框標(biāo)注的區(qū)域為成像區(qū)域，對樣品進行逐點掃描，重建顯微圖像如圖3(b)所示，其中偽彩條表示組織的粘彈比，由圖可知，頭發(fā)絲的粘彈比明顯小于周圍瓊脂。圖3(c)為顯微圖像3(b)中虛線位置處的重建剖面圖，由實驗結(jié)果，頭發(fā)絲半峰寬為57.9μm，說明該系統(tǒng)的成像分辨率至少能達到50μm左右。

圖3 (a)瓊脂中的頭發(fā)絲樣品;(b)樣品(a)中紅虛線框內(nèi)區(qū)域的光聲粘彈顯微成像;(c)粘彈顯微圖像(b)中虛線處的光聲信號相位延遲Fig.3 (a)Hair samples in agar;(b)Microscopic images of sample(a)within the red dotted area by photoacoustic viscoelasticity imaging;(c)Phase delay of photoacoustic signal at the dotted line in the microscopic images(b)

3.3 離體組織光聲粘彈顯微成像

為了驗證光聲粘彈顯微系統(tǒng)的成像能力，將一片動物肌肉、一片動物脂肪和一塊動物骨組織等具有不同粘彈性的生物組織置于同一平面內(nèi)并用瓊脂固定，如圖4(a)所示。對樣品進行逐點掃描，重建粘彈特性分布圖像如4(b)所示，其中偽彩條表示組織的粘彈比。由圖，脂肪相比于肌肉和骨組織具有更高的粘彈比，并且從光聲粘彈顯微圖像中可以清晰地看到不同組織之間的分界，圖4(a)與圖4(b)也符合的很好。結(jié)果表明，光聲粘彈顯微成像有較好的對比度和分辨率，可以很好的重建出生物組織粘彈特性分布的顯微圖像。

4 討論和結(jié)論

圖4 (a)由肌肉、脂肪和骨組織構(gòu)成的樣品;(b)樣品的光聲粘彈顯微圖像Fig.4 (a)Sample consists of muscle，fat and bone tissue;(b)Microscopic images of sample(a)by photoacoustic viscoelasticity imaging

該成像系統(tǒng)的精度主要受限于鎖相放大器的時間常數(shù)和信噪比，一個較大的時間常數(shù)會提高系統(tǒng)性能，但是會降低掃描速度，我們選擇30 ms進行實驗，這也是引起圖4中像素值分布不均勻的主要原因。此外，我們也考慮了在不同組織中聲速不同給相位測量帶來的誤差影響，對于厚度不足0.5 mm的樣品，經(jīng)過計算和實驗驗證由聲速差異引起的相位差小于0.1 deg，因此，在樣品不厚的情況下，這種影響可以忽略不計。超聲換能器固定于水槽底部，使得系統(tǒng)掃描時光聲信號由換能器單點接收，克服了換能器表面靈敏度不均勻的缺陷，大幅提高了系統(tǒng)的信噪比。若進一步選用高倍聚焦物鏡把入射光斑聚得更小將大大提高系統(tǒng)的成像分辨率，再用更高靈敏度的聚焦換能器來聚焦接收光聲信號，并實現(xiàn)反向接收模式，做成光聲共聚焦反向接收模式的成像系統(tǒng)，這種系統(tǒng)具有更高的信噪比和分辨率，有望實現(xiàn)組織結(jié)晶水平的高分辨率成像。

本文提出了一個用光聲粘彈顯微成像表征生物組織粘彈特性的新方法，搭建了一套基于電動平臺掃描的對向接收模式光聲粘彈顯微系統(tǒng)，用于毫米至厘米尺度范圍的生物組織成像。實驗結(jié)果表明該成像系統(tǒng)能夠高對比度和高分辨率的重建生物組織的光聲粘彈顯微圖像。這套系統(tǒng)最有潛力應(yīng)用于動脈粥樣硬化斑塊和早期皮膚腫瘤的診斷檢測，在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床研究中都有很大的應(yīng)用前景。

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