新型麥芽四糖酶及其應用

錢 瑩， 段 鋼

（杰能科（中國）生物工程有限公司，江蘇 無錫214028）

隨著人們對健康意識的逐步提高，含有大量高甜度，高熱量糖漿的食品正被越來越多的消費者所拋棄，進而轉向具有溫和的甜度，較低的熱量以及較高營養功效的食物。近年來發達國家對麥芽低聚糖的研究，因其顯著的保健功能，麥芽低聚糖已被做為一種“功能性食品”被人們所接受[1]。

麥芽四糖是麥芽低聚糖家族中的一員，由4個葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵連接而成。麥芽四糖的甜度只有蔗糖甜度的20%，但其粘度卻為蔗糖的2～5倍。麥芽四糖具有很好的保濕性，而且其低含量的葡萄糖與麥芽糖使得美拉德反應不容易發生。麥芽四糖具有低滲透壓及耐酸、耐熱等特性，因此其在食品行業中的應用頗廣[2]。麥芽四糖還由于其良好的成膜性而做為施膠劑用于造紙行業以及其與可溶淀粉相似性用于生化試劑分析行業[3]。麥芽四糖有諸多保健功能，如可抑制腸內腐敗菌的增殖，改善腸內環境；促進人體對鈣的吸收等[3]。鑒于麥芽四糖的眾多特性，日本學者Nakakuki稱其為最有希望的麥芽低聚糖[4]。

麥芽四糖糖漿一般是由淀粉經過酶解而制得。淀粉先在液化酶的作用下轉化成可溶性糊精，再由麥芽四糖酶水解，將長鏈的糊精降解為以麥芽四糖為主的小分子糖，最后經過分離純化制成麥芽四糖糖漿。目前研究報道的麥芽四糖淀粉酶主要來源于Pesudomonasstutzeri，Bacillus.circulans，Bacillussubtilis和Pesudomonas saccharophilia，其中大部分酶的pH使用范圍集中在中性及偏堿性，體系的反應溫度也不能高于60℃，但是在相對較低的溫度及高pH值的操作條件下，很容易造成系統染菌及糖液顏色變深，這對實際生產操作會造成很大的難度[6-12]。另外麥芽四糖酶的生產成本是另一個限制其商業化大規模使用的原因。

作者使用了一種新型的從Pesudomonas saccharophilia基因修飾而得到的麥芽四糖酶，該酶不僅具有一般淀粉酶的內切性質，能夠快速降低糊精的粘度，同時還具有外切酶的性質，產生大量的麥芽四糖。通過對其生產麥芽四糖糖漿工藝的研究以及優化，使其可以更加高效率更加方便的用于實際生產中。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米商品淀粉：山東諸城興茂公司產品；液化酶 Spezyme Fred，麥芽四糖酶 Optimal 4G，普魯蘭酶Optimax L-1000：杰能科公司產品，單糖，雙糖，三糖及四糖標準品：色譜級。

1.2 實驗儀器

快速水分測定儀：MA 30，德國Sartorius公司產品；電子恒溫水浴鍋：美國Fisher公司產品；電子天平：PL4002，瑞士Mettler公司產品；阿貝折光儀：RE40D，瑞士Mettler公司產品；高效液相色譜：HPLC，美國Agilent公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程 配料→調pH，加酶→噴射液化→維持→冷卻，調pH→糖化

1.3.2 高效液相色譜分析 示差折光檢測器，分離柱：Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid column；柱溫：60℃；流動相：0.005 mol/L硫酸；流量：0.6 mL/min，分析在常溫下進行15 min。

圖1 麥芽四糖的色譜分離圖譜Fig.1 HPLC of maltotetraose

2 結果與討論

2.1 pH對麥芽四糖酶的影響

以淀粉液化液做為底物，麥芽四糖酶在不同pH的反應體系中產生的麥芽四糖質量分數如圖2所示。

圖2 麥芽四糖酶在不同pH值條件下對麥芽四糖質量分數的影響Fig.2 Effect of system pH on maltotetraose-forming amylase performance

從圖2中可以發現，當糖液起始pH為4.0時，24 h的麥芽四糖質量分數就能夠達到44.5%以上。隨著pH的上升，麥芽四糖質量分數不斷升高，當pH達到5.0～5.5時，麥芽四糖質量分數達到最高點，而后麥芽四糖的質量分數隨著pH的升高后回落，但總的來講，麥芽四糖質量分數變化不是特別大。這說明該麥芽四糖酶的使用pH范圍很廣，這與以前報道過的麥芽四糖酶需在中性及偏堿性條件下才能發揮作用有很大不同。該酶能在偏酸的條件下發揮最佳作用對實際生產非常有利的，因為淀粉乳液化的pH值通常控制在pH5.2～5.8，如果糖化單元也可以在此pH范圍內操作，則可省去調節pH的步驟，非常方便。

2.2 溫度對麥芽四糖酶的影響

以淀粉液化液做為底物，麥芽四糖酶在不同溫度的反應體系中產生的麥芽四糖質量分數如圖3所示。

圖3 麥芽四糖酶在不同溫度下對麥芽四糖質量分數的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on maltotetraoseforming amylase performance

從圖3中可以發現，當反應溫度為50℃時，24 h的麥芽四糖質量分數就能夠達到44%以上。隨著溫度的上升，反應速度加快，麥芽四糖質量分數不斷升高，當溫度達到60℃時，麥芽四糖質量分數達到最高點，而后麥芽四糖的質量分數隨著溫度的升高而回落。當反應溫度在70℃時麥芽四糖質量分數仍然有44%。這說明此麥芽四糖酶的使用溫度范圍很廣，這與以前報道過的麥芽四糖酶在60℃已失活過半相比有很大不同[12]。反應體系的溫度升高，可以加快酶促反應的速度，同時反應在較高溫度下操作，還可以降低微生物染菌的可能，從而避免了目標產物的損失。

2.3 底物液化DE值對麥芽四糖酶的影響

在麥芽糖的生產過程中，底物液化液的水解程度對最終產物麥芽糖的質量分數影響較大。底物液化液的水解程度過高，即液化液的DE值過高，麥芽糖的最終產率將越低。那么在麥芽四糖的生產過程中，是否液化液的水解程度對其最終濃度也有影響。將不同DE值的麥芽糊精做為底物，對最終的麥芽四糖質量分數做了比較（圖4）。通過對比發現，液化液DE值的高低對麥芽四糖的最終產率也有著與麥芽糖生產相似的趨勢，隨著液化液的DE值的升高，麥芽四糖的質量分數逐漸降低。當底物液化液DE分析其原因可能是因為液化液的DE值越高，表明液化液體系內的糊精的分子鏈越短，特別是葡萄糖，麥芽糖等小分子的含量越高，造成麥芽四糖酶與目標底物的結合就越困難，因此對底物的水解越不利，從而造成麥芽四糖的最終質量分數不高。

圖4.不同底物的水解程度對麥芽四糖質量分數的影響Fig.4 EffectofdifferentliquefactDEonmaltotetraoseyield

2.4 普魯蘭酶與麥芽四糖酶的協同作用

普魯蘭酶是一種能夠水解淀粉中的α-1，6糖苷鍵產生直鏈糊精的脫枝酶。在淀粉糖生產中，由于液化酶與糖化酶水解支鏈淀粉的速度非常的緩慢，因此在糖化過程中，添加普魯蘭酶與糖化酶共同使用提高淀粉糖的產率。圖5顯示了不同計量的普魯蘭酶對麥芽四糖質量分數的影響。普魯蘭酶與麥芽四糖酶的協同作用效果明顯。當普魯蘭酶的添加量為100 g/t時，麥芽四糖的質量分數提高了不到1%，但是普魯蘭酶的添加量升高至500 g/t，麥芽四糖的質量分數已經由原來的45.7%升到48.3%。普魯蘭酶的計量繼續調高到1 000 g/t，麥芽四糖質量分數的升高并不明顯，這說明普魯蘭酶的添加量500 g/t以足夠。

圖5 麥芽四糖酶與不同普魯蘭酶協同作用對麥芽四糖質量分數的影響Fig.5 Effect of additional pululanase working with maltotetraose-forming amylase on maltotetraose yield

2.5 底物質量分數對麥芽四糖酶的影響

底物質量分數對酶促反應有著較大的影響，當底物質量分數較低時，反應速度會隨著質量分數的增加而增加。但是當質量分數達到一定程度，酶促反應速度的增加會放緩。但是從節能及設備利用率的角度，底物質量分數高是有利的。因此如何控制底物質量分數在最佳范圍對目標產物的產率有著實際的意義。從圖6可知，底物質量分數在20%時，麥芽四糖質量分數可以在50%以上，而當底物質量分數升高到32%時，麥芽四糖質量分數已經降至到48%左右。

圖6 不同底物質量分數對麥芽四糖質量分數的影響Fig.6 Effect of different substance concentration on maltotetraose yield

3 結語

通過對麥芽四糖酶的反應pH、溫度、底物質量分數以及與普魯蘭酶的協同作用的研究發現，新型的麥芽四糖酶可以在pH 4.0～7.0比較寬泛的條件下發生作用，麥芽四糖質量分數均可達42%以上，其最佳pH范圍在5.0～5.5之間，這與之前報道的大部分麥芽四糖酶需在偏中性或堿性條件下反應有很大的不同。由于淀粉的液化單元pH多控制在5.2～5.8，如果麥芽四糖酶反應過程也可以控制在此范圍內，則對生產操作非常有利，因為無需調節pH，這不僅節約了堿的用量，降低生產成本，同時也避免了大量離子的存在，減輕了后序的糖液離子交換環節的壓力。對于反應溫度，新型的麥芽四糖酶可以在60～65℃下進行反應，在此溫度下操作，可以降低微生物染菌的可能，從而避免目標產物的損失。研究還表明普魯蘭酶與麥芽四糖酶的協同作用效果明顯，底物質量分數不易過高，20%～30%即可。

[1]姜錫瑞，段鋼.新編酶制劑實用技術手冊［M］.北京：中國輕工業出版社，2002.

[2]DUAN GANG，QIAN Ying，et al.Improved production of maltotertraose syrup using a Pseudomonas Saccharophila maltoteraohydrolase variant and a debranching enzyme[P].WO：132157 A2，2010.

[3]朱明，吳嘉根.麥芽四糖的性質及在食品中的應用[J].冷飲與速凍食品工業，1999（4）：23-24.

[4]Kimura.Maltoteraose，a new saccharide of tertiary property[J].Starch，1990（42）：151-157.

[5]Yoshiyuki Takasaki.Method of using G-4 amylase to produce high maltotertraose and high maltose content sarch hydrolyastes[P].美國專利：US，4925795.

[6]Tae Un Kim.Purification and characterization of a maltotertraose-forming alkaline α-amlyase from an alkalophilic Bacillus Strain，GM8901[J].Applied and environmental microbiology，1995，61（8）：3105-3112.

[7]Yoshihiro Mezaki.Crystallization and structural analysis of intact maltoteraose-forming exo-amylase from Pseudomonas stutzeri[J].Biosci Biotechnol Biochem，2001，65（1）：222-225.

[8]Shuichiro Murakami，Kenji Nagasaki，et al.Purification and characterization of five alkaline，thermotolerant，and maltotertraoseproducing alpha-amylases from Bacillus haloduramns MS-2-5，and production of recombinant enzymes in Escherichia coli[J].Enzyme and Microbial Technology，2008（43）：321-328.

[9]Hayashi T，Akiba T.Properties of new alkaline maltohexose-forming amylases[J].Appl Microbiol Biotchnol，1998 （28）：281-285.

[10]Momma M.Cloning and sequencing of the maltohexose-producing amylase gene of Klebsiella pneumonia[J].Biosci Biotechnol Biochem，2000（64）：428-431.

[11]Hashim So.Alkaline active maltohexose-forming alpha-amylase from Bacillus halodurans LBK 34[J].Enzyme Microb Technol，2005（36）：139-146.

[12]Yoshiyuki Takasaki.Maltotetraose-producing amylase from Bacillus sp.MG-4+[J].Agric Biol Chem，1991，55（7）：1715-1720.