響應面法優化水飛薊粕固態發酵培養基的研究

李 峰， 張 敏， 鄒艷敏， 李 芳，朱伯樂， 趙 婷， 吳向陽， 仰榴青*

（1.江蘇大學 藥學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學 化學化工學院，江蘇 鎮江 212013；3.江蘇大學 環境學院，江蘇 鎮江 212013）

水飛薊（Sliybum maruianum （L.）Gaertn.）又名水飛雉、乳雉子，一至兩年生草本植物[1-2]。其有效成分水飛薊素具有清除自由基、抗脂質過氧化、抗肝纖維化、抗腫瘤和降血脂等生理活性[3]。近年來，隨著水飛薊素需求量的增加，水飛薊粕殘渣也隨之增多。水飛薊粕主要由蛋白質、粗纖維、多酚和黃酮類化合物等組成[4]，其中蛋白質質量分數為22%～25%[5]。但目前一般作為廢物丟棄，既浪費資源，又污染環境。如水飛薊粕直接作為動物飼料使用，存在消化性和適口性差的問題。因此，作者采用霉菌和酵母菌組成的混菌劑對水飛薊粕進行固態發酵，并優化固態發酵培養基組成，以期得到蛋白質含量高、適口性好的生物蛋白飼料，為水飛薊粕的開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

水飛薊粕：江蘇中興藥業有限公司；麩皮、玉米粉：市售 （所有原料粉碎后過40目篩）；黑曲霉40226（Aspergillus niger）和熱帶假絲酵母 1254（Candida tropicalis）：中國工業微生物菌種保藏中心提供；斜面培養基：黑曲霉：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基；熱帶假絲酵母：麥芽汁瓊脂培養基；液體種子培養基：黑曲霉：沙氏葡萄糖液體培養基；熱帶假絲酵母：麥芽汁培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將菌種接種于斜面培養基上，28℃培養72 h，置于4℃冰箱中保存備用。

1.2.2 液體種子培養 用接種環從真菌斜面取孢子一環，接入裝有50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，120 r/min、28℃震蕩培養48 h。

1.2.3 固態發酵 固態發酵培養基混合均勻，接種培養基干重10%的黑曲霉和熱帶假絲酵母混菌劑，調節含水量為60%，28℃培養72 h，45℃烘干，測定粗蛋白質質量分數。

1.3 單因素試驗[6]

1.3.1 物料組成對混菌固態發酵的影響 以粗蛋白質質量分數為指標，分別考察了不同物料組成對混菌固態發酵的影響。其中水飛薊粕∶麩皮∶玉米粉（質量比）分別選取 5∶3∶2、6∶3∶1、7∶2∶1、8∶1.5∶0.5、9∶0.5∶0.5 5 個水平。

1.3.2 碳源及其添加量對固態發酵的影響 在固態發酵基礎培養基中加入不同碳源，考察碳源對固態發酵的影響。其中，碳源分別為葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，添加量均為質量分數0%、0.5%、1%、2%、3%。

1.3.3 無機氮源及其添加量對固態發酵的影響在固態發酵基礎培養基中加入不同氮源，考察氮源對固態發酵的影響。其中，氮源分別為尿素、硝酸銨和硫酸銨，添加量均為質量分數0%、1%、1.5%、2%、2.5%。

1.3.4 無機鹽及其添加量對固態發酵的影響 在固態發酵基礎培養基中加入不同無機鹽，考察無機鹽對固態發酵的影響。其中，無機鹽為磷酸二氫鉀、氯化鈣和硫酸鎂，添加量均為質量分數0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%。

1.4 響應面設計

根據單因素試驗結果和Box-Behnken中心組合設計原理，選取葡萄糖、尿素和磷酸二氫鉀3個對粗蛋白質質量分數影響較大的因素為自變量，以發酵后產品粗蛋白含量為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗，對固態發酵營養因子進行優化；并進行驗證試驗，每次設3個平行。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Coded levels and factors of response surface analysis

1.5 分析方法

粗蛋白質質量分數測定：粗蛋白質測定采用半微量凱氏定氮法，參照國標GB/T 6432-94飼料中粗蛋白質測定方法，用于比較發酵前后的蛋白質氮量；粗蛋白質體外消化率測定：粗蛋白質體外消化率測定參照王衛國等[8]的方法。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 物料組成 由圖1可知，當固態發酵培養基中含水飛薊粕比例為80%時，蛋白質提高量相對較高，水飛薊粕所占比例少發酵基質粗蛋白質質量分數低，隨著發酵基質中水飛薊粕比例的升高，發酵樣品粗蛋白質質量分數增大，但超過90%后反而下降，這可能是由于水飛薊粕含量過多，培養基過于黏稠，不利于溶氧和傳質，影響菌體生長和產酶，導致發酵產品粗蛋白質質量分數降低。最終選定固態發酵培養基中基礎物料水飛薊粕：麩皮：玉米粉（質量比）為 8∶1.5∶0.5。

圖1 不同原輔料配比對粗蛋白質質量分數的影響Fig.1 Effects of different ratio of raw and auxiliary materials on crude protein content

2.1.2 碳源及其添加量對固態發酵的影響 碳源是微生物的重要營養物質，其主要作用是構成微生物細胞的碳架和供給微生物生長繁殖所需的能源。由圖2可知，3種碳源對水飛薊粕粗蛋白質質量分數均有提高，其中葡萄糖為碳源時，粗蛋白質提高量高于蔗糖和麥芽糖，且葡萄糖添加質量分數為1%時，發酵產品粗蛋白質質量分數提高最多。最終選擇葡萄糖作為固態發酵培養基的外加碳源。

2.1.3 無機氮源及其添加量對固態發酵的影響由圖3可知，3種氮源對水飛薊粕粗蛋白質質量分數均有提高，其中，尿素為氮源時，發酵產品粗蛋白質質量分數提高程度優于硝酸銨和硫酸銨，且尿素添加質量分數為1.5%時，發酵產品粗蛋白質質量分數提高最大。再增加尿素含量，粗蛋白質質量分數略有減少，這是因為尿素為非蛋白氮，相對分子質量較小，溶液滲透壓較高，含量過高時抑制菌體生長，影響粗蛋白質質量分數的增加。最終選擇尿素作為固態發酵培養基的外加氮源。

圖2 不同碳源對粗蛋白質質量分數的影響Fig.2 Effects of different carbon resources on crude protein content

圖3 不同氮源對粗蛋白質質量分數的影響Fig.3 Effects of different nitrogen resources on crude protein content

2.1.4 無機鹽及其添加量對固態發酵的影響 無機鹽是微生物生長繁殖必不可少的營養物質，是發酵過程中的生長刺激因子，對菌體的生長具有重要意義。由圖4可知，3種無機鹽對發酵產品粗蛋白質質量分數均有所提高，其中磷酸二氫鉀的促進作用最明顯，且添加質量分數為0.6%時，粗蛋白質質量分數最大。最終選擇磷酸二氫鉀作為固態發酵培養基的外加無機鹽。

2.2 響應面分析

根據3因素3水平的響應面試驗設計，共設有17個試驗點，其中12個為析因點，5個為零點以估計誤差。試驗設計和結果見表2。

圖4 不同無機鹽對粗蛋白質質量分數的影響Fig.4 Effects of different inorganic salt resources on crude protein content

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

根據試驗結果，利用Design Expert 7.0軟件對試驗數據（表2）進行回歸擬合，得到多項式響應面回歸模型：

對所得模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，總模型P＜0.000 1，表明該模型高度顯著，失擬項不顯著（P=0.595 6＞0.05），表明模型選擇正確。相關系數R2=0.984 1，表明預測值與實測值之間具有較好的相關性，校正相關系數R2Adj=0.963 6，說明響應面96.36%的變化可以由此模型解釋，擬合程度較好，實驗誤差小，可用來分析和預測固態發酵培養基最佳營養因子水平。而且，由表3中所測系數及對應的P值表明，方程的一次項顯著，其中X1、X2項極顯著；二次項極顯著，其中X12、X22項極顯著，X32項顯著；交互項中除X1和X2交互作用不顯著外，其他交互項的影響也是顯著的，說明因素之間的交互作用很明顯，因此可以用此回歸方程代替各組試驗對試驗結果進行分析。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

利用Design Expert7.0軟件對回歸模型進行響應面分析得到各響應面3D分析圖，見圖5。從圖5可以看出，各因素對提高水飛薊粕粗蛋白含量的影響順序為：葡萄糖（X1）＞尿素（X2）＞磷酸二氫鉀（X3），其中磷酸二氫鉀對試驗影響不顯著。通過對模型的擬合分析以及單因素試驗結果，預測出最佳培養基組成為：水飛薊粕∶麩皮∶玉米粉（質量比）為 8∶1.5∶0.5，添加質量分數1.11%葡萄糖、1.40%尿素和0.56%磷酸二氫鉀。響應面模型在此條件下預測的發酵產物粗蛋白質質量分數為38.70%。

圖5 葡萄糖（X1）、尿素（X2）和磷酸二氫鉀（X3）對粗蛋白質質量分數影響的響應面分析圖Fig.5 Response surface plot for the effects of glucose（X1），urea （X2）and potassium dihydrogen phosphate（X3）on crude protein content

2.3 驗證試驗

按照響應面優化得到的最佳培養基條件，進行驗證試驗，所得發酵后水飛薊粕粗蛋白質質量分數為38.43%，與理論預測值相差0.27%，說明該模型能較好地預測發酵情況。

2.4 體外消化率測定

樣品中蛋白質的體外消化率采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步消化法測定，發酵后水飛薊粕粗蛋白體外消化率為88.92%，較未發酵水飛薊粕粗蛋白體外消化率（70.12%）有顯著提高，說明水飛薊粕蛋白質在發酵過程中被水解為小分子蛋白或多肽，甚至氨基酸，更易被消化吸收，因而營養價值得到提高。顧賽紅等[9]利用黑曲霉PES固態發酵使棉籽粕粗蛋白體外消化率提高13.11%。該結果與文獻報道一致，混菌固態發酵能夠明顯的提高水飛薊粕蛋白質的體外消化率。

3 結語

固態發酵培養基的最佳組成：水飛薊粕∶麩皮∶玉米粉（質量比）為 8∶1.5∶0.5，添加質量分數 1.11%葡萄糖、1.4%尿素和0.56%磷酸二氫鉀，發酵水飛薊粕粗蛋白質質量分數和體外消化率分別可達38.43%和88.92%。該工藝穩定可行，為水飛薊粕固態發酵生產蛋白質飼料提供了一定的理論依據。

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[2]M Angeles Sánchez-Sampedro，Rafael Peláez，Purificación Corchete.An arabinogalactan protein isolated from medium of cell suspension cultures of Silybum marianum （L.）Gaernt[J].Carbohydrate Polymers，2008，71（4）：634-639.

[3]劉洪玲.水飛薊素的化學成分及藥理作用研究進展[J].中國民族民間醫藥，2008，23-25.LIU Hong-ling.Progress of chemical composition and pharmacological effects of Silymarin [J].Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2008，23-25.（in Chinese）

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[5]孫艷輝，董英，齊麗麗.超聲輔助提取水飛薊粕蛋白[J].糧油加工，2007（4）：58-60.SUN Yan-hui，DONG Ying，QI Li-li.Ultrasonic assisted extraction of protein of milk thistle meal[J].Cereals and Oils Processing，2007（4）：58-60.（in Chinese）

[6]王衛國，鄧金明，廖再生.飼料粉碎粒度與蛋白質消化率的體外消化試驗研究[J].糧食與飼料工業，2000（11）：16-19.WANG Wei-guo，DENG Jin-ming，LIAO Zai-sheng.A trial study on the relationship between particle size of feed ingredients and digestibility of protein in vitro method[J].Cereal&Feed Industry，2000（11）：16-19.（in Chinese）

[7]顧賽紅，孫建義，李衛芬.黑曲霉PES固體發酵對棉籽粕營養價值的影響[J].中國糧油學報，2003，18（1）：70-73.GU Sai-hong，SUN Jian-yi，LI Wei-fang.The nutritional value of cottonseed meal fermented by A niger[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2003，18（1）：70-73.（in Chinese）