林蛙皮膠原蛋白肽酶解工藝數學建模及抗氧化作用的研究

邱芳萍， 王長周， 季曉楓

（長春工業大學 化學與生命科學學院，吉林 長春 130012）

林蛙是我國東北地區集藥、食于一體的珍貴蛙種，養殖量和商品量逐年增加，據不完全統計，全省年產蛙量在十億余只，蛙油產量200 t左右，蛙油年產值10億元左右，而蛙油僅占整蛙的15%，其它部位（腦、皮、肉和骨）作為廢棄物或飼料，資源浪費，污染嚴重而林蛙皮中含有豐富的蛋白質、氨基酸、膠原蛋白、抗菌肽和透明質酸等生物活性物質，具有重要的應用價值及較大的開發利用潛力。

作者以長白山林蛙皮為原料，經酶解和膜分離手段等一系列工藝過程，建立了酶解最佳工藝的數學模型，制備出具有特殊分子結構、功能復雜多樣的生物活性物質，對其溴代苯小鼠肝損傷及SOD、GSH-Px活力的影響進行了研究，以此證明：LWT可以作為新型的化妝品及保健品的原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆明小鼠：雌性，體重25～30 g，吉林大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK-（吉）2008-0005；LWT：長春工業大學功能食品與生物技術研究所制備，批號：20101210；血紅蛋白，SOD，MDA，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒：南京建成生物技術公司產品；丙烯酰胺，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

日普利RPL-D2000 COLUMN HBATER高效液相色譜：山東魯南瑞虹化工儀器有限公司產品；DYY-8C型電泳儀：北京市六一儀器廠產品。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝 蛙皮→溶脹→酶解→過濾→脫腥→活性炭脫色→膜分離純化→濃縮→冷凍干燥→微黃色粉末狀LWT

1.3.2 水解度的測定 采用游離氨基氮甲醛快速滴定法[2]測定林蛙皮的水解度。

1.3.3 酶解工藝的優化 采用數理統計和數據擬合分析方法對LWT酶解過程中的加酶量、酶解溫度、酶解時間、pH、料液質量體積比5因素進行優化，建立LWT酶解過程中影響因素與水解度關系的數學模型。

1.3.4 相對分子質量測定 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳[3]的方法測定LWT的相對分子質量。

1.3.5 純度檢測 高效液相色譜分析條件[4]：紫外-可見光檢測器；色譜柱：C18，250 mm×4.6 mm；流動相：v（乙腈）∶v（水）∶v（三氟乙酸）=20∶80∶0.1；波長：220 nm；流量：1 mL/min；柱溫：30 ℃；質量濃度：1 mg/mL；進樣量：15～30 μL。

1.4 抗氧化活性實驗

取健康雌性昆明小鼠，隨機分為對照組、模型組及LWT低劑量組 （200 mg/kg）、中劑量組（600 mg/kg）、高劑量組（1 800 mg/kg），每組各 15 只。3 個LWT組給予不同劑量連續等體積灌胃，對照組和模型組動物灌胃給予同等容量的生理鹽水。

末次給藥后，摘眼取血，分別SOD活力和GSH-Px活力[5]，除對照組，其余各組灌胃給0.47 mg/kg溴代苯油，對照組給予色拉油，灌胃量為0.2 mL/20 g。經一系列處理后，測定丙二醛質量分數和SOD活力和GSH-Px活力及勻漿液蛋白質質量分數。溶血液和肝組織的MDA質量分數采用硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法[6]測定，血紅蛋白、蛋白質質量分數、SOD、GSH-Px活力的測定參照試劑盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 最佳酶解條件的確定

采用數理統計和數據擬合分析方法建立酶解工藝優化條件的數學模型，把加酶量作為水解度的重要影響因子，其他酶解條件可以作為次要影響因子。由一元插值可確定pH、酶解溫度、酶解時間3個變量與加酶量均有線性關系，可做如下假設：x為林蛙皮在酶解反應中加酶量的大小，且為水解度的第一影響因子；xi（i=1，2，3）為 x 的影響因子（其中，x1為酶的 pH，x2為酶解溫度，x3為酶解時間）；y 為林蛙皮酶解反應后的水解度，這里其為目標函數；由實驗數據得到如下關系曲線，見圖1～3。

圖1 酶解溫度與加酶量的關系Fig.1 Relations between add enzymequantityand enzymatic hydrolysis temperature

圖2 加酶量與pH的關系Fig.2 Relations between add enzyme quantity and pH

圖3 酶解時間與加酶量的關系Fig.3 Relations between addenzymequantityand enzymatic hydrolysis time

根 據 上 面 數 據 可 知 ：x1=k1x+b1；x2=k2x+b2；x3=k3x+b3；其中 ki=1，2，3，b=1，2，3 為常數。

由上面的數據可確定如下：k1=5，b1=5.5，k2=25，b2=32.5，k3=2.5，b3=1.25。

從上面可得到x1與x之間的關系。

水解度是這里最為重要的指標，y=f（x）是目標函數。

y受兩個因素的影響，一是加酶量的多少x（它與 xi，i=1，2，3 之間的關系已經討論過），二是料液質量體積比。結果見圖4，圖5。

圖4 料液質量體積比與水解度之間的關系Fig.4 Relations between hydrolyzing degree and ratio of solid to liquid

圖5 加酶量與水解度之間的關系Fig.5 Relations between add enzymequantityand hydrolyzing degree

根據圖4，曲線可由代數方程表示：令y=axk+b

水解度與酶解溫度、酶解時間、pH值、酶量的大小均有直接的關系，通過實驗給出的數據分析，當溫度在50°、酶解時間約3.0、pH值時：

設水解度為 y（%），加酶量為 x（%），利用最小二乘法可得酶量與水解度之間的模型為：

如圖 6（a），（b）所示：

圖6 加酶量與水解度之間的關系模型Fig.6 Relational model between enzyme quantity and hydrolyzing degree

圖6（a）是在加酶量1.5%范圍內的局部情況，圖6（b）較圖6（a）的范圍擴大了到了加酶量為10%的情況，分析上述結果，當加酶量在0.5%時，水解度可達到6.02%，當酶量在0.58%時，水解度可達到6.038%，當加酶量在0.6%時，水解度可達到6.04%，當酶量在1.2%時，水解度可達到6.10%，當酶量在8%時，水解度可達到6.247%。顯然，當酶量x＞0.58時，水解度增加趨于平緩。

綜上分析，確定最佳酶解條件為：加酶量0.55%～0.58%，酶解時間 3.0 h，酶解溫度 50℃，pH 9.0，料液比1 g∶3 mL，經試驗驗證，酶解工藝條件與模型條件吻合。

2.2 相對分子質量分布

聚丙烯酰胺凝膠電泳結果見圖7。

圖7 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.7 Polyacrylamide gel electrophoresis figure

電泳結果顯示，該LWT的相對分子質量在3 500以下，兩個不同質量濃度的加樣量基本上在同一相對分子質量水平上。

2.3HPLC圖譜

高效液相色譜圖表明LWT純度較高，結果見圖8。

圖8 LWT高效液相色譜圖Fig.8 HPLC figure of LWT

2.4LWT對小鼠血液中SOD、GSH-Px活力的影響

LWT低、中、高劑量組小鼠血液中SOD與GSH-Px活力與對照組相比較有所提高，但無統計學意義（P＞0.05），實驗結果見表 1。

表1 LWT對小鼠血液中SOD、GSH-Px活力的影響Table 1 Influence of LWT on the SOD and GSH-Px vitality in mice blood

2.5 LWT對小鼠肝臟組織中MDA質量分數及SOD、GSH-Px活力的影響

模型組與對照組比較肝臟組織中MDA質量分數明顯升高（P＜0.05）。LWT高劑量組小鼠肝組織中MDA質量分數與模型組相比顯著降低，具有統計學意義（P＜0.05）；LWT高劑量組小鼠肝組織中SOD活力與模型組相比較顯著升高，具有統計學意義（P＜0.05）；GSH-Px活力各組之間無顯著性差異 （P＞0.05），實驗結果見表 2。

表2 LWT對小鼠肝臟組織中MDA質量分數及SOD、GSH-Px活力的影響Table 2 Influence of LWT on the MDA content and the SOD and GSH-Px vitality in liver tissue

3 結語

對長白山林蛙進行了綜合利用研究，運用數學建模優化酶解工藝條件，得到最佳酶解條件為：加酶量0.55%～0.58%，酶解時間3.0 h，酶解溫度50℃，pH 9.0，料液質量體積比 1 g∶3 mL，在此條件下制備出LWT。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜分析方法，證明了該LWT的相對分子質量均在3 500以下，且純度較高。

通過小鼠實驗，對所得數據進行統計學分析，最后得出結論：LWT具有顯著降低小鼠肝組織中MDA含量和顯著升高小鼠肝組織中SOD活力的作用，LWT的抗氧化動物實驗結果為陽性，具有抗氧化作用。

林蛙由于生長環境和習性，其安全性、保濕性、抑菌抗菌性，抗氧化、抗衰老等方面都有獨特的天然優勢，是適用于新型化妝品基料的綠色材料。該LWT可以作為新型化妝品和保健品的原料，具有較大的開發潛力和較高的應用價值。

[1]何照范，張迪清.保健食品化學及其檢測技術[M].北京：中國輕工業出版社，1997.

[2]夏其昌，張祥民，周仲駒，等.蛋白質電泳技術指南[M].北京：化學工業出版社，2007.

[3]Bunger H，Kaufner L，Pisonu.Quantitative analysis of hydrophobic pulmonary surfactant protein by high-performance liquid chromatography with light-scattering detection[J].J Chromatoger A，2000，870（1-2）：363-369.

[4]VishnuduttP，Bin G，Byoung-Joon S.Molecularmechanisms of al-coholic fatty liver[J].Alcohol Clin Exp Res，2009，33（2）：191-205.

[5]Negre-SalvayreA，CoatrieuxC，Ingueneau C，et al.Advanced lipid peroxidation end products in oxidative damage to proteins：Potential rolein diseases and therapeutic prospects for the inhibitors[J].British Journal of Pharmacology，2008，153（1）：6-20.