酶解雞骨架制備熱反應底物的研究

趙永珍， 張 慜*， 陳志雄

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.廣東嘉豪食品股份有限公司，廣東 中山528447）

雞肉香味鮮美，風味怡人，深受人們的喜愛。為此，人們希望能給一些食品賦予雞肉香味，由此促進了人們對雞肉香精的研究。雞汁調味料是以磨碎的雞肉和雞骨或其濃縮提取物以及其他輔料等為原料，添加或不添加香辛料和（或）食用香料等增香劑加工而成，具有雞的濃郁鮮味和香味的汁狀復合調味料。熱反應產生的雞肉香精由于香氣強烈、逼真度高、抗氧化性好受到研究人員的重視。近年來，國外對熱反應雞肉香精的研究較為活躍，而國內在這方面的研究還相對薄弱和滯后，到目前為止，關于如何生產雞肉香精的有關信息還較少[1]。

水解蛋白由于富含氨基酸、氨基酸鈉鹽與多肽，其通常可作為鮮味料或通過與還原糖發生美拉德反應制備熱加工肉類香精。Spanier的研究表明：多肽在牛肉加工、水解植物蛋白、烤可可與咖啡的風味形成過程中起著非常重要的作用，不同的多肽序列作為前體物質將產生不同的食品風味。因此，當通過美拉德褐變生產特定風味化合物時，水解蛋白的游離氨基酸的組成與含量、相對分子質量分布、多肽的組成及化學構型等對美拉德反應中形成的風味物質的種類等具有非常重要的影響[2-3]。

目前肉味香精發展于近30年，其主流是酶解技術用于水解氮源物質，用水解動物蛋白（HAP）、水解植物蛋白（HVP）作為肉味香料的前體物，再配合以氨基酸、酵母膏、還原糖和脂肪等物質，經美拉德反應形成香氣濃郁圓潤、口感醇厚逼真的肉味香精[4]。

作者以雞骨架為底物，通過酶法水解制備雞骨架蛋白水解物，作為Maillard的反應物，用以對不同水解度的酶解產物對美拉德產物風味形成的影響進行探討。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

凍藏雞骨架：購于無錫市濱湖區歐尚超市；Flavourzyme風味蛋白酶，Protamex復合蛋白酶，木瓜蛋白酶，Novozym37071酶：廣州明耀商貿有限公司提供。

1.2 主要儀器與設備

恒溫水浴鍋，立式高壓蒸汽滅菌鍋，精密酸度計，絞肉機，消化爐，改良式凱氏定氮裝置，電子天平，冷凍離心機，馬弗爐，電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.3 測定方法

1.3.1 酶解工藝的研究方法

1）酶的選擇實驗：采用風味蛋白酶和復合蛋白酶（F：P），風味蛋白酶和木瓜蛋白酶（F：PP）以及風味蛋白酶和Novozym37071酶 （F：N）3種不同復配酶進行水解，對酶解液的水解度及感官進行比較，選擇最佳復配酶。復配酶的兩種酶質量比為1∶1，酶用量為0.4%，料液質量體積比為1 g∶2 mL，在各自的適宜水解條件下水解。

酶適宜作用條件根據酶生產廠家提供的資料和預試驗確定：風味蛋白酶和復合蛋白酶適宜溫度為55℃，pH為6.0；，風味蛋白酶和木瓜蛋白酶的適宜溫度 55 ℃，pH 6.5； 料液比 1 g∶2 mL，Novozym 37071酶和風味蛋白酶的適宜溫度55℃，pH為6.5。

2）酶配比的選擇：用以上所確定的最佳酶組合，選擇不同的雙酶組合比例，以水解度和蛋白質回收率為考察指標，選擇最優配比。

3）酶用量的選擇：選定料液比為 1 g∶2 mL，水解時間3 h，酶用量0.2%～1.0%，pH值6.8，水解時間3 h，測定其DH，確定最適酶用量。

4）料液比的選擇：選定pH 值6.8、溫度55℃、上述確定的酶用量料液質量體積比分別在1 g∶1 mL～1 g∶5 mL 條件下水解 3 h，分別測定其 DH，確定最佳料液比。

5）酶解溫度的選擇：選定水解時間3 h，pH值6.8，上述確定的酶用量，料液質量體積比，分別在45～65℃條件下水解，分別測定D H，確定最適酶解溫度。

6）酶解pH值的選擇：選定水解時間3 h，上述所確定的酶用量、溫度，及料液質量體積比，pH值為5.5～7.5，分別測定其DH，確定其最適pH值。

7）酶解時間的選擇：按選定的最佳參數，酶解時間分別為1～7 h測定其水解度，確定最佳酶解時間。

8）最佳工藝條件的確定：根據單因素試驗的結論，選擇酶解溫度、時間、pH值、加酶量4因素，每因素三水平設計正交試驗，其因素水平設計見表1。取 L9（34）正交表，做正交試驗。

表1 復合蛋白酶和風味蛋白酶的酶解正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test of enzymolysis condition byFlavourzyme andProtamex

1.3.2 雞骨架酶解的工藝流程 雞骨架→預處理→高溫蒸煮（120℃，1 h）→粉碎→加去離子水→調節pH值→加酶恒溫水解→100℃滅酶15 min→4 800 r/min離心20 min→過濾→雞骨架水解蛋白液。

1.3.3 檢驗方法 蛋白質質量分數的測定：凱氏定氮法：GB/T5009.5-2003；水解度的測定：參照參考文獻[5]

氨基酸態氮的測定：甲醛滴定法，參照國家標準GB/T5009.39-2003。蛋白質利用率的測定：按以下公式計算。

蛋白質利用率=（酶解上清液中總氮質量分數/原料中總氮質量分數）×100%

產品感官品評[6]：就樣品的嗅感、口味、色澤、外觀等方面評價產品的質量，各指標按很弱 （----）、弱（---）、較弱（--）、稍弱（-）、一般/不存在（0/×）、稍 好 （+）、較 好 （++）、好 （+++）、很 好（++++），由5人組成感官評價小組，對不同工藝的產品進行對比鑒評，根據可接受性進行綜合評價。

2 結果與討論

2.1 原料的預處理

首先是對凍藏的雞架進行解凍，然后對原料進行清洗、去雜，特別是雞架，還有一些內臟殘留物要去除；另外是汆湯，主要目的是去血去異味，因為血污都含有不同的腥味，如果直接蒸煮，會使湯液帶腥且混濁，影響風味及色澤，所以必須經過汆燙，讓殘留的血凝固，經過沖洗后以除去血及一些異味且經過汆湯后所得雞湯較清澈。在工業化生產中不能像傳統方法那樣，邊熬煮邊撇去浮沫，可將粉碎后的骨頭用冷水浸泡20 min是骨頭中的血液滲透到水中，這樣就可以把浮沫的問題解決好[7]。

另外，為了增加骨內含物與水的交流，有必要對骨頭適當破碎和加壓處理，便于呈味物質的溶出。利用高壓處理可分解膠原蛋白為可溶性水解物，讓人們容易吸收這些小分子營養物，且高壓把骨渣充分預處理，骨頭變酥更易于酶與底物的接觸，酶解主要作用于肌肉纖維中的蛋白和部分已經溶出的膠原蛋白，這樣可以提高原料的利用率。作者采用120℃蒸煮1 h，時間小于1 h時尚有骨頭沒有充分變酥，大于1 h時，蒸煮液的蒸煮味嚴重，故選擇1 h為宜。

2.2 酶的選擇

2.2.1 酶的種類選擇 酶法水解的動物蛋白有一定的苦味，NEYKH[8]等曾研究表明蛋白質水解產物的苦味和蛋白質的疏水性值有關。當蛋白質疏水值較大時，用不含端肽酶的蛋白酶水解就會產生較強的苦味。苦味肽的端基多為疏水氨基酸，如果用外切酶切除此類疏水氨基酸，游離出的疏水氨基酸與原苦味肽相比苦味要低的多。風味蛋白酶既是內切酶也是外切酶，因此風味蛋白酶在一定程度上能有效脫苦。所以采用木瓜蛋白酶、復合蛋白酶以及Novozym37071酶這3種內切蛋白酶和風味蛋白酶按質量比1∶1復配后，在各自適宜的條件下對雞骨蛋白的酶解效果進行比較。結果如圖1。

圖1 不同酶對水解度影響Fig.1 Effect of enzyme on degree of hydrolysis

表2 F∶P酶解不時間對感官指標的影響Table 2 Effects of enzymolysis time onSensory indexes by Flavourzyme and Protamex

表3 F∶PP酶解不同時間對感官指標的影響Table 3 Effects of enzymolysis time onSensory indexes by Flavourzyme and Papain

表4 F∶N酶解不同時間對感官指標的影響Table 4 Effects of enzymolysis time onSensory indexesby Flavourzyme andNovozym37071

通過比較發現利用風味蛋白酶和復合蛋白酶復配進行酶解所得的酶解液水解度最高，且總體風味最好，故以下實驗采用風味蛋白酶和復合蛋白酶復配酶解制取雞骨蛋白酶解液。

2.2.2 酶的配比選擇 由圖2可知，當風味蛋白酶用量逐漸增多，復合蛋白酶所占比例變小時，水解度不斷增加，而蛋白質的利用率卻在減小。在比例為1∶2時，水解度與蛋白質回收率相對較高。因此，從酶解效果和經濟角度考慮，復合蛋白酶和風味蛋白酶的酶配比為1∶2時為最佳方案。有關酶解的研究表明，復合蛋白酶的內肽酶較強，總體的水解力較強，但水解程度不夠徹底；而風味蛋白酶的端肽酶較強，能更徹底地將蛋白質和肽水解成為氨基酸，這可能是導致當風味蛋白酶的比例增加時水解度增加而蛋白質利用率下降的原因[9]。

圖2 復合蛋白酶與風味蛋白酶的配比對水解度及蛋白質回收率的影響Fig.2 Effect of ratioof Flavourzyme and Protamex on degree of hydrolysis and Protein recovery

2.3 單因素結果分析

2.3.1 酶質量分數的選擇 當料液比一定，增加的酶量又未使底物濃度飽和時，加酶量越大，反應速度也越快，蛋白質的水解度也越高。但當繼續增加加酶量，生產成本也相應提高，同時，也有可能導致酶自身相互水解，使酶活力降低，實驗結果如圖3所示。由圖3可知，水解度隨加酶量的增大而增加，但加酶量大于質量分數0.8%時，酶解度增加減緩，考慮到生產成本問題，選擇加酶量0.8%較為合適。

圖3 加酶量對水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis

2.3.2 料液比的選擇 料液比對水解反應效果有影響，主要是因為料液質量體積比的變化會引起酶反應體系中底物和酶質量分數的變化。由圖4可知，隨著料液質量體積比的增加，水解度不斷增加。而實際生產中，水分過多，濃度則越稀，作為商品，仍需要濃縮，耗能大。綜合考慮，確定料液質量體積比為 1 g∶2 mL。

圖4 料液比對水解度的影響Fig.4 Effect of solid liquid ratio on degree of hydrolysis

2.3.3 酶解溫度的選擇 由圖5可知，在一定的溫度范圍內隨著反應溫度的升高，水解度不斷增加但超過一定溫度后，水解度會隨著溫度的升高而降低。這是因為在一定范圍內升高溫度，反應速度加快，酶解效率也相應提高，但溫度過高，酶蛋白變性，酶的穩定性下降，酶解效率隨之降低。所以，最適溫度為55℃。

2.3.4 酶解pH值的選擇 pH值影響酶的穩定性，所以pH值對水解反應影響很大。各種酶都有各自的最適pH值范圍，由圖6可知，pH 6.5左右時，水解度最大，所以復合蛋白酶和風味蛋白酶復合的最適pH值取6.5。

圖5 溫度對水解度的影響Fig.5 Effects of temperature on degree of hydrolysis

圖6 pH對水解度的影響Fig.6 Effects of pH on degree of hydrolysis

2.3.5 酶解時間的選擇 由圖7可知，隨著時間的增加，水解度不斷增加，當增加到一定程度，時間為3 h的時候，增加的速度開始變慢，綜合考慮效率及成本的問題，單因素水解時間最優選4 h。

圖7 酶解時間對水解度的影響Fig.7 Effects of enzymolysis time on degree of hydrolysis

2.4 最佳工藝條件的確定

通過酶解單因素試驗選擇最佳的條件，根據L9（34）正交表對其進行正交試驗優化，結果見表5，趨勢圖見圖8。由表5和圖8可以看出，各因素影響的主次關系為D＞C＞B＞A即酶用量>酶解時間>酶解溫度>酶解pH。各因素的最優水平組合為D3C3B2A2即酶用量為8‰，酶解溫度為55℃，酶解時間為5 h，酶解pH值為6.5。

表5 酶解正交試驗設計方案及結果Table 5 Design and resultsoforthogonaltestfor enzymolysis

圖8 酶解正交試驗因素趨勢圖Fig.8 Statistic curve oforthogonalfactorsduring enzymolysis

3 結語

作者通過對不同種類的酶水解所得的酶解液的感官品評及水解度的比較，篩選出最佳的酶組合為復合蛋白酶和風味蛋白酶，當兩者以1∶2的質量比復配時，蛋白質回收率及水解度都相對較高。并在一系列的單因素基礎上，以水解度為特征指標，通過4因素3水平正交實驗對復合蛋白酶與風味蛋白酶的復配水解雞骨架工藝條件進行優化，得出最佳酶解工藝條件為溫度55℃，pH值6.5，加酶量0.8%，水解時間5 h。此時酶水解雞骨泥的水解度為23.69%。在后續的研究中，可以在以上優化條件下改變水解時間，獲得不同相對分子質量的多肽和氨基酸的酶解液，以研究不同水解度的蛋白質水解液對美拉德反應的影響。

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