經門靜脈藥物灌注化療栓塞治療大鼠肝泡狀棘球蚴病的電鏡觀察

朱帝文， 穆 民， 任偉新， 胡漢華， 湯朝安， 溫 浩

肝泡狀棘球蚴病（泡球蚴病）是一種對人體危害極大的人畜共患寄生蟲病，有“蟲癌”之稱。大多數患者早期癥狀輕微，診治較晚，已有較廣泛的肝臟和鄰近臟器的浸潤，手術切除率較低，10年內死亡率可高達80%［1］。目前，阿苯達唑被認為是治療泡球蚴病的首選藥物。但該藥的治愈率僅為30%左右，并且療效不穩定，個體差異大［2］。

本研究通過建立肝泡球蚴病大鼠模型，開腹門靜脈穿刺直接灌注阿苯達唑脂質體及碘化油混懸液，模擬介入治療途徑，觀察治療后大鼠的肝臟組織病理學變化，并探討其治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型復制及分組

1.1.1 實驗動物 種鼠為長沙爪鼠1只，體重65 g。清潔級Wistar大鼠40只，雄性38只，雌性2只，鼠齡 2～3月，體重（200± 18）g。

1.1.2 模型建立 40只Wistar大鼠用10%水合氯醛按3 ml/kg腹腔注射麻醉，用1 ml注射器經皮肝臟穿刺肝右葉注射20%泡球蚴原頭節懸液0.2 ml，接種6個月后行超聲檢查及開腹探查。

1.1.3 動物分組 利用隨機數字表將實驗動物分為對照組5只和實驗組35只。接種6個月后，取復制成功的大鼠肝泡球蚴病模型，對照組大鼠開腹，采集標本，行超微結構觀察；實驗組大鼠門靜脈穿刺緩慢注入阿苯達唑脂質體0.1 ml和超液態碘化油 0.1 ml，共 0.2 ml，分別于 4、7、10 d 后處死動物，采集標本。

1.2 電鏡標本制備

手術刀切取組織標本，固定2 h，用緩沖液漂洗5 min后依次進行梯度脫水、浸透、包埋、聚合。在甲苯胺藍染色干燥后光鏡下觀察，對照定位后，60～80 nm超薄切片，再進行染色，電鏡觀察，拍片。

2 結果

2.1 模型復制

40只Wistar大鼠接種6個月后，行超聲檢查示21只大鼠感染泡球蚴，19只未感染，經開腹探查后證實超聲檢查21只陽性中有1只未感染。實際成功復制模型為20只。20只陽性大鼠中單發病灶17只，2個或多個病灶3只，病灶最大直徑為3.2 cm。將20只陽性大鼠分為對照組1只，實驗組19只。

2.2 電鏡超微結構觀察

圖1 對照組角質層、生發層清晰，生發層微絨毛致密排列，分布均勻（×8 000）

對照組泡球蚴組織角質層、生發層清晰，生發層微絨毛致密排列，分布均勻（圖1）。實驗組第4天泡球蚴囊壁角質層外側處聚集大量溶酶體，可見有巨噬細胞、漿細胞等炎性細胞；囊壁內側溶酶體數量較外側少，并觀察到髓鞘樣結構。泡球蚴生發層、角質層結構未見明顯改變（圖2a）。第7天生發層微絨毛增粗變短，排列稀疏，部分闕如，角質層結構疏松。皮層細胞區內細胞數量稍有減少，細胞排列較疏松。皮層細胞突起減少，其內有少量空泡，內質網增多，稍有擴張，溶酶體數量較前減少，部分轉化為次級溶酶體，糖原顆粒較多，囊壁內有較多脂質體顆粒（圖2b～2d）。第10天囊壁部分皺縮，其外可見成纖維細胞和膠原纖維，呈纖維化表現；生發層、角質層部分融合，或難以辨認，微絨毛少量或闕如；皮層區變薄或消失，內部結構被破壞，表面微毛很難見到。皮層細胞變少，部分脫落壞死，可見凋亡小體形成。脂質體被分解為直徑較小的顆粒，廣泛分布于囊泡內，皮層區。有少量溶酶體、次級溶酶體及空泡形成（圖 2e）。

3 討論

肝泡球蚴病的首選治療方式為根治性手術切除，但大部分患者就診時肝內重要血管、膽管及周圍臟器受侵，根治性切除率低［3］，且術后并發癥較多［4］。而肝移植術治療晚期肝泡球蚴病，術中根治性切除面臨很大困難，術后長期免疫抑制劑的應用使泡球蚴病的復發和再感染率增加，治療費用增加，難以推廣［5］。非根治性手術治療方法，如肝泡球蚴不完全切除術、經皮穿刺液化壞死引流、肝泡球蚴經皮肝穿刺膽管引流等，能夠改善患者癥狀，但術后存在膽瘺等并發癥，生存期并未延長［6］。對無法行根治性切除治療的晚期泡球蚴病患者，阿苯達唑仍是目前首選的治療方法［3］，但其效果不理想，主要原因是由于血液與病變區的藥物濃度差異顯著，囊液和囊壁的藥物只有血液中的十分之一到百分之一，而大劑量則使藥物毒性反應明顯［7］。在目前尚無新的、有效的抗包蟲藥物應用于臨床，如何提高阿苯達唑的治療效果顯得尤為重要。

圖2 實驗組治療不同時間內超微結構所見

介入治療通過靶血管藥物灌注及栓塞，能夠消除口服藥物治療的缺點，使藥物定向或集中于肝泡球蚴組織，提高藥物在局部病變組織的濃度，從而提高阿苯達唑等藥物的治療效果。根據國內外報道的血管造影表現，顯示肝動脈是泡球蚴病灶的主要血供來源，實驗研究表明門靜脈亦參與了部分血供［8］。 目前，經肝動脈介入治療已應用于臨床［9］，單純經動脈化療栓塞可能對泡球蚴病灶有直接的治療效果，但如門靜脈參與供血，直接動脈內給藥不能完全阻斷肝泡球蚴病灶的滋養血管，治療效果將會下降。

本研究中，電子顯微鏡觀察發現，治療后第4天泡球蚴組織基本正常，可見有巨噬細胞、漿細胞等炎性細胞聚集，以炎性改變為主。阿苯達唑脂質體及碘油到達病灶部位后需要通過一系列反應，經過一段時間才能發揮作用，引起組織與形態變化。第7天可見泡球蚴組織結構發生變性改變，生發層微絨毛稀少，角質層結構疏松。泡球蚴囊壁內有較多脂質體顆粒。第10天可見肝泡球蚴組織結構破壞，囊泡塌陷，生發層、角質層結構壞死退變，原頭蚴形態、結構紊亂，部分發生壞死。脂質體被分解為直徑較小的顆粒，廣泛分布于囊泡內，皮層區。從實驗結果分析，治療后肝泡球蚴組織病理學的改變是一個漸進的過程，表明經門靜脈注射阿苯達唑脂質體碘化油混懸液后，能夠引起泡球蚴組織退行改變，甚至死亡，從而發揮抗包蟲病作用。

張金輝等［10］報道，以 50 mg/kg 劑量，每周 3 次，連續10周，口服及腹腔注射阿苯達唑脂質體治療長沙爪鼠肝泡球蚴病，病理觀察以Ⅰ級和Ⅱ級改變為主。 劉章鎖等［11］分別以 37.5、75、150 mg/kg 的不同劑量，每周3次，連續6周，口服及腹腔注射阿苯達唑脂質體治療小白鼠肝泡球蚴病，泡球蚴呈變性和壞死改變。口服和腹腔注射兩種給藥途徑間，不同給藥劑量之間變化無顯著性差異。Rodrigues等［12］，靜脈注射阿苯達唑納米粒子膠體注射液，治療6周，總劑量分別為6、12、24 mg/kg，結果表明其作用與口服6周，總劑量1 500 mg/kg的原粉等效，未見毒性反應，且不同劑量間無明顯差異。本實驗采用門靜脈灌注阿苯達唑脂質體碘化油混懸液，阿苯達唑脂質體劑量參照Rodrigues等［12］的實驗研究，阿苯達唑脂質體為0.1 ml，約20 mg/kg，與0.1 ml碘化油混合成混懸液。治療后7、10 d即觀察到泡球蚴組織變性、壞死改變。與口服、腹腔注射、靜脈注射相比，從組織學上觀察，門靜脈介入途徑在較短時間內獲得了相近的療效。其主要原因可能為：①門靜脈直接灌注阿苯達唑脂質體，可以顯著增加局部藥物濃度，同時阿苯達唑脂質體具有良好的肝臟靶向性，大部分在肝臟內代謝，在肝臟內轉化為阿苯達唑亞砜與阿苯達唑砜，迅速、有效的發揮殺傷泡球蚴的作用［13］，從而消除口服及靜脈給藥的局部藥物濃度低、全身不良反應大的缺點，提高治療效果。②碘化油具持續化療和部分栓塞作用。治療第4、7天，在泡球蚴囊壁及囊腔內均可見碘化油顆粒沉積。第10天仍可觀察到碘油顆粒，未被清除。碘油顆粒能夠滯留于泡球蚴病灶的可能原因為泡球蚴組織缺乏能夠清除碘油的單核-巨噬細胞系統和淋巴系統。說明碘油能夠攜帶阿苯達唑進入泡球蚴組織內，緩慢釋放阿苯達唑，發揮持續化療作用。并且碘油顆粒存留于泡球蚴組織能夠阻斷營養供給，發揮部分栓塞作用，加速泡球蚴組織的缺血壞死和鈣化。

此外，在實驗組中，因手術、實驗干預及其他不可預料的意外原因，在開腹門靜脈穿刺直接灌注阿苯達唑脂質體及碘化油混懸液后，第4～7天死亡1只，第7～10天死亡2只。其主要原因可能為：①實驗方法為開腹門靜脈穿刺進行化療栓塞，未能進行超選擇性動脈栓塞，對肝功能損害較大，引起肝功能衰竭死亡。②相對于大鼠門脈血管，碘油脂質體混懸液顆粒粒徑較大，正常肝組織清除較為困難，阻斷門靜脈血液供應可加重肝功能損害。

總之，門靜脈灌注阿苯達唑脂質體碘油混懸液治療肝泡球蚴病療效迅速、確切。其意義在于通過門靜脈介入治療使治療期明顯縮短或獲得二期手術機會。同時可阻斷泡球蚴門靜脈分支血供，減少其通過血行擴散轉移的概率。門靜脈灌注阿苯達唑脂質體的體內藥物代謝動力學、肝動脈與門靜脈的雙重介入化療栓塞治療有待于進一步研究。

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