HPT-mCherry融合標簽在水稻轉基因篩選鑒定中的應用

陳娟 ，周潔 ，嚴成其 ，王栩鳴 ，楊勇 ，余初浪 ，程曄 ，陳劍平

1.浙江師范大學 生化學院，浙江 金華 321000；2.浙江省農業科學院 省部共建國家重點實驗室培育基地，農業部植物保護與生物技術重點實驗室，浙江省植物病毒重點實驗室，浙江 杭州 310021

農桿菌介導的水稻轉基因技術是利用生物學手段將目的基因導入水稻基因組中的重要方法，主要用于水稻性狀的改良和基因功能的研究[1-2]。自1994年Hiei等建立農桿菌介導的水稻轉化體系以來[3]，水稻轉基因技術得到了廣泛應用和發展。水稻轉基因技術需要借助標記基因來篩選轉化子，實驗中常用的標記基因分為兩類，即選擇基因和報告基因[4]。目前常用選擇基因對轉化的材料進行較為高效的篩選，并利用其他實驗進行輔助篩選。常用的選擇基因包括潮霉素磷酸轉移酶基因（hygromycin phosphotransferase gene，HPT）[5]和抗除草劑基因（bi?alaphos resistance gene，bar）[6]等。使用潮霉素篩選抗性愈傷，可能篩選得到假陽性的愈傷組織，往往需要借助PCR等方法檢測進行輔助鑒定，而這些方法通常都比較耗時費力。為了提高輔助篩選的效率，目前很多研究選用報告基因進行輔助篩選。報告基因是一種編碼可被檢測的酶或蛋白質的基因，例如β-葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase gene，gus）和熒光蛋白基因等[7-8]。gus通過編碼β-葡萄糖苷酸酶將底物水解為藍色產物，可進行組織化學檢測，但檢測過程中需要破壞植物組織，限制了其在活體中的應用[9]。相比gus基因，熒光蛋白基因的檢測較為簡便，被廣泛使用。

雖然報告基因的輔助篩選是一種比較經濟有效的方式，但還是存在一些無法避免的缺陷。最主要的缺陷就是報告基因需要額外的啟動子和終止子來控制其表達。啟動子和終止子是控制基因表達的重要元件[4]，而轉基因實驗中常用啟動子和終止子數量有限，重復使用相同的啟動子或終止子，會導致轉化時發生遺傳重組，存在一定的風險[4,10]。以植物轉基因中常用的CaMV（花椰菜花葉病毒）35S啟動子為例，該啟動子可以在植物體內保持較高水平的表達，但該啟動子內含有一個重組熱點（TATA box），會使轉基因不穩定，發生遺傳重組[11]。此外，使用多個啟動子和終止子會占用多個內切酶位點，使得構建轉基因載體時策略設計更為復雜。在本研究中，我們嘗試使用HPT-mCherry融合蛋白標簽，利用HPT和mCherry篩選轉基因材料。mCherry是由DsRed突變得到的單體紅色熒光蛋白，在587 nm激發光下發出紅色熒光，可以排除葉綠素的干擾[12-14]。利用潮霉素篩選陽性愈傷，并使用熒光顯微鏡觀察愈傷組織和植株，操作簡單，準確率較高，可以提高實驗結果的可靠性。

我們構建了HPT-mCherry融合標簽，用單一的融合蛋白同時實現篩選基因和報告基因的功能。實驗結果顯示，HPT-mCherry融合標簽能有效地篩選陽性愈傷，鑒定得到陽性植株。

1 材料及方法

1.1 材料

日本晴水稻（Oryza sativa L.spp.japonica cv.Nipponbare）、根 瘤 農 桿 菌（Agrobacterium tumefa?ciens）EHA105均為本實驗室保存；TRIzol試劑（Invit?rogen公司）；iScriptcDNA合成試劑盒、SsoFast EvaGreen Supermix試劑盒、（Bio-Rad公司）；質粒提取試劑盒（Promega公司）；LightCycler 480定量PCR儀（Roche公司）；NanoVue紫外分光光度計（GE公司）；熒光體式顯微鏡（Leica公司）；燈式熒光檢測器（BLS公司，匈牙利）。

1.2 質粒的構建

本研究中的相關載體骨架來自pCAMBIA1300（Canberra公司，澳大利亞）。p1300URF載體（圖1B）攜帶CaMV35S啟動子驅動的HPT-mCherry融合基因。實驗中以p1300UR-mC載體（圖1C）作為陽性對照，攜帶Ubiqitin啟動子（玉米泛素基因啟動子）[15]驅動的mCherry基因和CaMV35S啟動子驅動的HPT基因。

為了構建包含HPT-mCherry融合標簽的p1300URF載體，通過序列分析，使得標記基因HPT和mCherry通過一個短的多聚甘氨酸鏈相連，得到融合片段。該片段包括3個小片段，片段1包含部分HPT基因和Link序列,片段2包含mCherry基因和Link序列，片段3包含載體的部分序列。首先用引物P1和P2擴增片段1、P3和P4擴增片段2、P5和P6擴增片段3，然后將上述PCR產物稀釋至1/100后作為模板，用引物P1和P6通過融合PCR技術[16]合成完整的改造片段。采用凝膠回收試劑盒回收PCR產物，用RsrⅡ和SacⅡ酶切，將酶切片段連入經相同的內切酶酶切的目標載體pCAMBIA1300UR，熱擊轉化大腸桿菌，篩選正確克隆，保菌備用。引物及序列見表1。

1.3 農桿菌介導的水稻轉化

挑選飽滿的種子，去殼后置于50 mL無菌離心管中，用無菌水清洗1次；加入30 mL 75%乙醇消毒1 min；棄乙醇，用無菌水清洗后，加入30 mL次氯酸鈉（活性氯濃度為1.25%），攪拌后靜置30 min；棄次氯酸鈉，用無菌水清洗3次，轉入誘導培養基[17]中，28℃培養至得到愈傷顆粒。

將含有目標載體的農桿菌懸浮于AAM培養液（D600nm=0.08～0.1）中，挑取誘導得到的水稻愈傷組織，置菌液中侵染15 min；棄上清，超凈臺中晾30～40 min；棄菌懸液，將愈傷組織置于共培養基[18]上，20℃暗培養3 d；用無菌水清洗愈傷組織5～6次，轉移至選擇培養基[18]上光照培養20 d，用Leica熒光顯微鏡檢測帶有紅色熒光的愈傷組織，并將其轉移至新鮮的選擇培養基上進行第二輪選擇，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出；挑取抗性愈傷移入分化培養基[18]中，28℃培養至分化成苗。

1.4 轉基因材料的鑒定

水稻轉基因材料DNA的提取參考CTAB小量提取法[19]。用引物HPT-FL-F/HPT-FL-R進行PCR檢測。PCR條件：95℃ 10 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s，35個循環。

1.5 轉基因水稻熒光檢測

用Leica熒光體式顯微鏡和BLS燈式熒光檢測器觀察轉化愈傷組織及轉化植株的紅色熒光。

表1 實驗中使用的引物序列

1.6 RNA的提取及逆轉錄PCR

取100 mg水稻樣品置于預冷的研缽中，用液氮充分研磨，加入1 mL TRIzol試劑繼續研磨至粉末，按照TRIzol試劑說明書提取水稻總RNA，最后加入20～40 μL無RNase的水溶解RNA沉淀。用iScript cDNA合成試劑盒進行逆轉錄，得到cDNA。

1.7 熒光定量PCR檢測

用質粒提取試劑盒提取p1300URF質粒，用紫外分光光度計進行質粒濃度測量，并按下式計算質粒摩爾濃度[20]：

將質粒p1300URF進行1/10梯度稀釋，分別稀釋為 105、106、107、108、109、1010和 1011copies/μL 共 7個梯度的標準樣品，作為模板；以mCherry-RT-F/mCherry-RT-R和HPT-RT-F/HPT-RT-R為引物，采用SsoFast EvaGreen Supermix試劑盒進行qRT-PCR（PCR 條 件 ：94℃ 3 min；94℃ 20 s、58℃ 20 s、72℃ 20 s，40個循環），然后根據7個標準樣品的Ct值計算模板起始濃度，并以模板起始濃度為橫坐標、Ct值為縱坐標，制作標準曲線[21]。

2 結果

2.1 利用融合標簽有效篩選陽性愈傷

將包含p1300URF質粒的農桿菌與粳稻品種日本晴的愈傷組織進行共培養，3 d后選擇培養。實驗中使用包含p1300UR-mC質粒的農桿菌進行轉基因操作作為陽性對照。對選擇20 d的愈傷組織進行觀察，結果顯示，成功轉化的愈傷組織在515～588 nm激發光照射下發出紅色熒光，轉p1300URF愈傷組織的熒光強度較弱，但不影響mCherry作為報告基因篩選陽性愈傷組織的功能（圖2A～D）。經過統計，p1300UR-mC和p1300URF分別轉化了306塊和301塊胚性愈傷組織，通過兩輪潮霉素篩選，分別獲得259塊和204塊獨立轉化的表達紅色熒光的抗性愈傷組織，轉化效率分別為84.6%和67.8%。上述結果表明，HPT與mCherry融合后，轉化效率雖然有所降低，HPT-mCherry融合標簽中的HPT基因仍然可以有效篩選陽性愈傷。結合熒光觀察，對照組和融合標簽組都能進一步快速篩選陽性愈傷。

圖1 p1300UR（A）、p1300URF（B）和p1300UR-mC（C）載體圖

圖2 轉基因水稻熒光檢測

2.2 利用融合標簽鑒定轉基因植株

對7 d苗齡的轉基因水稻進行熒光檢測（圖2E、F），陽性對照的根、芽和莖均有較強的紅色熒光，雖然受融合的HPT基因影響，轉p1300URF的植株熒光強度較弱，但紅色熒光仍然可以清晰地區分轉化與未轉化植株。為進一步驗證融合標簽熒光輔助篩選的有效性，我們隨機選取轉了14株轉化植株進行PCR檢測，各陽性轉基因植株均擴增得到1023 bp的片段（圖3），與通過熒光顯微鏡觀察紅色熒光的檢測結果完全一致，說明HPT-mCherry融合標簽在轉基因鑒定中能夠替代常用PCR檢測方法，從而大量節省實驗時間和相關耗材。上述結果表明，在轉基因植株中，HPT與mCherry融合后相互間影響較小，可以正常用于轉基因植株鑒定。

2.3 HPT和mCherry基因在mRNA水平上的表達分析

將濃度為105ng/μL（即 1.58×1013copies/μL）的質粒 p1300URF分別稀釋至 105、106、107、108、109、1010和1011copies/μL作為模板，制作HPT和mCherry基因擴增效率的標準曲線，得到HPT和mCherry標準曲線的相關系數分別為0.998和0.996。提取轉基因陽性愈傷和植株的總RNA進行qRT-PCR，通過絕對定量PCR分析，得到各株系中HPT和mCherry的表達量分別為107.06和107.81copies/μL。從mRNA水平證明采用融合標簽后，mCherry和HPT能在轉基因愈傷和植株中高效表達。參見圖4。

圖3 轉p1300URF的水稻植株HPT基因的PCR檢測

圖4 轉基因材料的絕對定量PCR分析

3 討論

隨著水稻轉基因技術的成熟，轉化頻率不再是T-DNA轉化的主要限制因素。在水稻轉基因研究中，轉基因后代的鑒定和遺傳分析主要利用潮霉素抗性基因的PCR或GUS酶活性進行檢測，但這些方法工作量大，比較費時。mCherry是一個單體熒光蛋白，其波長較長（587/610 nm），成熟時間較短（t1/2≈0.25 h），在融合外源蛋白時受影響較少[22]。我們構建了HPT-mCherry融合標簽載體，并確認了融合蛋白能有效發揮抗性基因功能，行使抗潮霉素的功能，也能有效地產生紅色熒光，從而實現可視化篩選。

用HPT-mCherry融合標簽進行鑒定，在避免了繁雜工作的同時保證了實驗結果的可靠性。而且，該方法還避免了使用2套啟動子和終止子分別控制HPT和mCherry的表達，有效減少了遺傳重組的風險，同時避免了占用大量限制性內切酶位點，方便了載體的進一步使用。

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