果蠅蛋白質組學研究進展

邢曉華 ，楊曉明 ，徐平

1.北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124；

2.軍事醫學科學院 放射醫學研究所，北京 100850；3.北京蛋白質組研究中心，北京 102206

果蠅（Drosophila melanogaster）是一種雙翅目（Diptera）昆蟲，因喜好腐爛的水果及發酵的果汁而得名。由于個體小、繁殖快、生活史豐富、染色體少、突變多等一系列優點，果蠅已成為生命科學領域最常用的一種模式生物[1]。

果蠅是多細胞生物，具有復雜的發育過程和豐富的行為學特征，與人類在身體發育、神經退化、腫瘤形成等的調控機制上有很多相通之處，其調控規律也與人類極其相似，許多人類基因在果蠅上也有，甚至功能可以互通[2]。因此，在20世紀生命科學發展的歷史長河中，果蠅扮演了十分重要的角色。遺傳學、發育的基因調控、各類神經疾病、帕金森病、老年癡呆、藥物成癮和酒精中毒、衰老與長壽、記憶與某些認知行為的研究中都有果蠅的“身影”[3]。目前果蠅基因組方面的研究也已相當成熟。2000年，果蠅全基因組測序完成。該基因組中編碼蛋白質的基因有13 600多個，數量少于線蟲。但因果蠅存在復雜的生活史和形態變化，因此其基因的功能調控更為復雜多樣。長期的系統研究也使果蠅的基因組成為至今注釋最好的基因組之一[4]。另外，果蠅擁有目前國際上應用最廣泛的在線數據庫Flybase，利于對其蛋白質的功能和結構進行進一步的分析[5]。

盡管果蠅的研究在遺傳學和基因組方面已非常成熟，但蛋白質是生命活動功能的直接承擔者，在果蠅蛋白質組水平的研究可以直接獲得基因在細胞內的確切功能，是系統鑒定、定量蛋白質，并研究其生物學功能的重要手段。最重要的是，在蛋白質組層面，果蠅作為無脊椎模式生物，在氨基酸序列水平與脊椎動物的同源性最高，結合果蠅的遺傳學、基因組學及生理學研究技術基礎，能夠對其如此豐富且與人類極其相似的生活史調控規律進行深度解讀[6]。因此，果蠅蛋白質組學研究引起了生命科學界的廣泛重視，成為當今國際生命科學和生物技術領域最活躍的學科前沿。

但由于技術的限制，至今在果蠅蛋白質組學方面的研究報道并不多見。我們對近年來的果蠅蛋白質組學研究進行了綜述，主要包括果蠅蛋白質組的產生背景，以及在表達譜、修飾譜、比較蛋白質組學和疾病模型蛋白質組學等方面的進展，并對果蠅蛋白質組學的發展前景進行了展望，為進一步開展人類疾病模型的果蠅蛋白質組學研究奠定基礎。

1 果蠅及其蛋白質組的研究內容

果蠅的生活史包括卵、幼蟲、蛹、成蟲等4個連續的但形態完全不同的變態發育階段。其生活周期十分短暫，在25℃、60%相對濕度條件下約為10 d。通過控制養殖溫度，可以加速或減緩果蠅的發育。果蠅個體很小，成蟲果蠅體長僅為3～4 mm，且雄性較雌性偏小。果蠅的染色體數目少，其核型只包括4對同源染色體，其中1對為性染色體，3對為常染色體。果蠅的性別決定方式為XY型，雄性異配，因此常常被用作驗證性別決定的實驗素材[7]。

基于清晰的遺傳背景和便捷的遺傳操作，果蠅在發育生物學、生物化學、分子生物學等領域都占據了不可替代的位置，在神經科學領域也得到越來越廣泛的應用。隨著現代分子生物學技術的日臻成熟，對果蠅的研究已遠遠不止停留在基因和遺傳學的層次上，科學家更關注果蠅基因如何調控蛋白質的表達，并進而對生命活動進行直接調控，揭示人類生命的奧秘。

隨著人類基因組學計劃的逐漸成熟，分子水平的實驗技術不斷發展，果蠅蛋白質組學研究的各個方面均有較大突破，新的研究內容和方法不斷出現。

2 果蠅蛋白質組表達譜

基于凝膠電泳體系的蛋白質鑒定策略是近年來果蠅蛋白質組學研究常用的技術策略，主要包括2種技術：一是基于2-DE的傳統的蛋白質組學研究方法，二是基于一維凝膠電泳分離-高效液相色譜分離和串聯質譜技術（GeLC-MS/MS）的蛋白質組學研究策略。但由于技術的限制，果蠅蛋白質組學研究，尤其是大規模的蛋白質組學研究報道尚不多見。為得到覆蓋率更高的果蠅蛋白質組表達譜，各種新方法不斷產生，比較有效的是將樣品分為不同的組織和器官分別進行鑒定，不但可以提高鑒定率，也可以為研究特定組織和器官提供更為詳盡的蛋白信息，實現生物功能專一性和多樣性（表1）。

2.1 基于2-DE的傳統的蛋白質組學研究方法

基于2-DE的傳統的蛋白質組學研究方法在前期的果蠅蛋白質組學研究中占據主要地位。Alonso等[8]利用2-DE技術研究了果蠅線粒體的蛋白質組，鑒定到231個銀染的多肽，對應了66個線粒體蛋白質；并且用相似的技術體系對果蠅成蟲的翅膀胎盤進行了蛋白質組分析，共鑒定到1492個多肽，對應了100多個蛋白[9]。Vierstraete等[10]利用該技術對果蠅幼蟲血淋巴的分泌蛋白質組進行了分析，分別得到脂多糖、啤酒酵母和藤黃微球菌等3種物質感染下發生免疫的蛋白質10、20和19個。Takemori等[11]用相似的技術體系發現了440個果蠅雄性生殖系統（包括睪丸、精囊、附屬腺、射精管和射精管球）組織特異的蛋白。Lee等[12]利用雙向電泳技術鑒定了果蠅頭部中的1500個熒光蛋白點，得到650個蛋白質，其中500個屬于果蠅頭部特異的蛋白質。

雙向電泳可分離上千種蛋白質，并獲得該蛋白的等電點和相對分子質量，但也存在不易分離強疏水性、低溶解度、極酸或極堿的蛋白質，以及繁瑣、不穩定、靈敏度低等缺點[13-14]。

表1 以果蠅為模式生物的蛋白質組表達譜研究進展

2.2 基于高效液相色譜分離和串聯質譜技術的蛋白質組學

近幾年中，基于高效液相色譜分離和串聯質譜技術的蛋白質組學逐漸成為主流的全蛋白質組研究方法。Bunner等[15]報道了基于LC-MS/MS蛋白質組技術的首例大規模果蠅蛋白質組學研究成果，選取果蠅卵、幼蟲、蛹和成蟲等4個發育階段及Kc167和S2等2個細胞系作為研究材料，在多種蛋白提取分離鑒定技術的支持下，經若干次重復試驗，共鑒定到9124個蛋白，對應8672個基因，成為迄今最大規模的果蠅蛋白質組研究。

組織特異和亞細胞水平的蛋白質組學研究是蛋白質組學領域中的一支新生力量。它一方面降低樣品的復雜度，使分析簡單化；另一方面可以相對富集相應亞細胞結構的低豐度蛋白，而且可以部分提示蛋白質的定位和功能信息，成為蛋白質鑒定及其功能研究的紐帶。由于果蠅這個多細胞生物的復雜的發育過程、豐富的行為學特征及不斷改進的多種策略和技術方法，其亞細胞蛋白質組學研究進展非常迅速，一些重要的亞細胞結構的蛋白質組不斷得到分析，并已深入到亞細胞器和復合體水平。Was?brough等[16]利用LC-MS/MS的方法分離分析了果蠅精子蛋白質組，獲得了包含956個精子相關蛋白的數據集。Muller等[17]分析了果蠅胚胎中心體的蛋白質組學研究，共鑒定到蛋白251個。Khanna等[18]利用相似方法研究了質膜蛋白質組，鑒定了432個蛋白。Cammarato等[19]也利用該方法對145個果蠅心臟組織進行蛋白質組分離分析，共鑒定了1228個相關蛋白質。不但如此，亞細胞蛋白質組還向更深方向發展。Anholt等[20]以果蠅觸角為研究材料，初步探索了果蠅的可溶性蛋白質組，發現了100多個相關蛋白。這些有益的嘗試都加深了我們對蛋白質在特異組織及細胞內的特異表達、轉運、定位及其生物學功能的理解。

3 果蠅蛋白質組修飾譜

蛋白質翻譯后修飾在生命活動中起著十分重要的作用，它使蛋白質的結構更為復雜、功能更為完善、調節更為精細、作用更為專一。研究較多的果蠅的蛋白質翻譯后修飾形式主要是磷酸化、泛素化、糖基化、類泛素化及組蛋白的甲基化。在體內，各種翻譯后修飾過程不是孤立存在的，而是相互作用、共同調節的。

3.1 磷酸化修飾

蛋白質磷酸化修飾涉及細胞信號傳導、神經活動、肌肉收縮及細胞的增殖、發育和分化等生理、病理過程，在生命活動發展中發揮著巨大的作用。Zhai等[21]利用一套完整的磷酸化富集和鑒定體系，包括強陽離子交換色譜、金屬離子親和色譜和高精度的質譜體系，在果蠅的胚胎中共鑒定到13 720個磷酸化位點，來自2702個蛋白，建立了當時規模最大的果蠅磷酸化數據集。在果蠅的蛋白質磷酸化修飾的蛋白質組學研究中，人們致力于不斷提高磷酸肽的富集效率和質譜的鑒定水平，以此提高果蠅蛋白質組的磷酸化修飾譜。Pinkse等[22]利用基于二氧化鈦富集的二維色譜方法，使果蠅S2細胞系的磷酸肽鑒定量與僅借助SCX相比翻了4番，高達2152個，大大加強了磷酸肽的富集效果。Bodenmiller等[23]不但通過改進磷酸肽的富集方式將果蠅Kc167細胞系的磷酸肽的鑒定從299提高到494個，并且經MS3質譜譜圖的確認，提高了鑒定的可信度，也將磷酸化肽的鑒定數目提高到505個，其中25個蛋白（5%）都是這種新方法單獨鑒定的結果。這一嘗試使果蠅的磷酸化蛋白質組學研究有了巨大飛躍。另外通過將ETD和CID結合，進一步提高了果蠅Kc167細胞系磷酸化肽的鑒定率，其中ETD單獨鑒定了153個磷酸肽。這與提高磷酸肽富集效率的方法異曲同工，對果蠅修飾蛋白質組的鑒定做出了巨大貢獻[24]。Courcelles等[25]發明了一種算法，可以鑒定磷酸肽的同分異構體，在果蠅的磷酸化蛋白質組鑒定中共得到15 700個磷酸肽，證明了在LC-MS的洗脫層面有8%～12%的磷酸肽都含有同分異構體。

3.2 泛素化和類泛素化修飾

蛋白質泛素化和類泛素化修飾對于蛋白質的定位、代謝、功能、調節和降解起著重要作用。隨著蛋白質翻譯后修飾研究的不斷深入，蛋白質泛素化的新的功能不斷被挖掘，包括參與細胞周期、增殖、凋亡、分化、轉移、基因表達、轉錄調節、信號傳遞、損傷修復、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調控，并且在腫瘤、心血管等疾病發病中起十分重要的作用，是近年來生物化學研究的一項重大成果，亦是研究、開發新藥物的新靶點。Franco等[26]利用蛋白質組學策略，在果蠅的胚胎細胞中鑒定到48個神經細胞特異的泛素化底物。更為重要的是，這些泛素化底物都是首次被鑒定到，并且沒有任何同源的蛋白質具有泛素化的證據，說明這種蛋白質組學方法鑒定的神經細胞的泛素化底物并不與其他細胞類型共有。Nie等[27]在果蠅的早期胚胎細胞中鑒定到140個早期類泛素化底物，并且驗證了這些底物分別參與細胞周期調控、Ras信號通路和早期形體形成過程。類泛素化蛋白質組學數據集的產生，為以后研究類泛素化的功能提供了便利。Xu等[28]發展了一種果蠅近乎全標記的SILAC方法，并發現果蠅在成蟲期隨年齡的增長K48和K63泛素鏈具有不同的變化趨勢，表明蛋白質的泛素化及其狀態和生物壽命相關。

3.3 組蛋白修飾

組蛋白上的翻譯后修飾主要有4種情況，即乙酰化、磷酸化、甲基化和ADP-核糖基化。甲基化和乙酰化與轉錄調節有關，特別是組蛋白乙酰化對于哺乳動物生物鐘的調控是非常重要的[29]。Ardehali等[30]通過多線染色體染色和活細胞成像技術，首次發現了一種位于啟動子區域的負責組蛋白H3K4三甲基化的蛋白dSet1。該蛋白依賴的H3K4三甲基化負責染色體結構的形成，并保證RNA聚合酶Ⅱ的合成供給，進而完成對轉錄活性的調節。

Imhof等[31]發現組蛋白H1的修飾形式隨多細胞生物的不同生長階段而變化。以果蠅胚胎為例，S10期的H1單磷酸化豐度明顯比胚胎期的少，說明翻譯后修飾與細胞周期和細胞分化相關。這是首次在果蠅中進行組蛋白的翻譯后形式的鑒定，為后續研究提供了依據。

乙酰化對基因表達的調控已廣為人知。這一新的研究更讓人們確定組蛋白的乙酰化對基因表達的調控具有廣泛的作用[32]，而果蠅可以作為很好的模型來驗證這一論斷，進而推動組蛋白修飾在生命發展過程中發揮更加積極的作用。

4 果蠅比較蛋白質組

蛋白質組具有動態、多樣和時空特異性。即使在細胞發育的不同階段，因不同時期、不同條件，蛋白質組的構成也不斷地變化。因此，分析比較不同條件下蛋白質組的變化和差異，發現和鑒定在不同生理條件下蛋白質組中的差異組分，從中揭示生命的奧秘，這些構成了比較蛋白質組學的研究內容。然而，比較蛋白質組學研究由于并不要求捕獲“全部”蛋白，而重在找出有意義的差異蛋白，因而在技術上有著相當高的可實現性。目前常用的方法主要分為有標定量（labeling quantitation）和無標定量（la?bel-free quantitation）2類。有標定量又可分為化學標記方法［如同位素標記的親和標簽（isotope-cod?ed affinity tag，ICAT）、串聯質譜標簽（tandem mass tag，TMT）、同位素相對標記與絕對定量技術（isobar?ic tagging for relative and absolute quantitation，iTRAQ）］和代謝標記方法［（細胞培養氨基酸穩定同位素標記（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）、15N代謝標記方法］[33]。目前果蠅中應用較廣泛的有15N標記、SILAC、iTRAQ及無標定量方法。

4.1 15N標記方法

2003年Krijgsveld等[34]首次提出了果蠅全蛋白質組的代謝標記策略。用只含15N的培養基標記酵母，再以此喂養生長在以這些標記酵母為惟一氮源的培養基中的果蠅卵，經質譜鑒定發現15N的標記效率約為95%，證明果蠅可通過1個世代得到幾乎完全的標記。Findlay等[35]利用該技術研究了果蠅交配時精液蛋白對生殖的影響，發現了19個原先沒有注釋的基因。這種代謝標記和非標記果蠅可在蛋白樣品抽提前混合，因此可以極大地減少樣品操作過程引起的誤差。缺點是不同肽中標記的氮原子數目不同，致使標記與非標記肽的相對分子質量位移在鑒定前不能預測，且標記肽段形成寬泛的同位素峰分布，增加了蛋白質鑒定中的假陽性率和定量的難度。

4.2 SILAC標記方法

與15N標記方法不同，SILAC標記是利用重穩定性同位素標記的氨基酸在生長過程中對目標蛋白質組進行標記。這種標記和非標肽段的相對分子質量位移是可以提前預測的，并且隨后的蛋白質分離、酶切、鑒定等所有過程都在同一條件下進行，誤差小，重復性好，因此逐漸取代15N標記方法而成為現階段同位素代謝標記的金標準[37]。Bonaldi等[38]利用ISWI基因缺陷型果蠅模型和對照組的SILAC方法標記果蠅SL2細胞系，用LTQ-Orbitrap質譜儀鑒定到4119個蛋白，同時得到了因ISWI基因表達水平的改變而引起的幾百個在轉錄組和蛋白質組水平表達產生顯著差異的蛋白。Sury等[39]報道，在果蠅中SILAC標記的效率可以達到近100%，為果蠅的SILAC標記提供了更廣闊的應用空間。Xu等[28]也利用賴氨酸重標酵母的方法對果蠅進行了近乎完全的標記，并在果蠅的泛素化蛋白質組研究中得到良好的應用，為果蠅翻譯后修飾蛋白質組的研究奠定了堅實基礎。

4.3 ICAT標記方法

ICAT是由Gygi等[40]開發的一種同位素親和標簽標記和定量蛋白質組學研究策略。該方法通過在蛋白水平分別加入不同標記的ICAT試劑，反應后等比例混合進行消化和質譜分析。實踐表明ICAT試劑存在一些不足，如不能分析半胱氨酸缺失的蛋白質、標記和非標記肽不能被同步洗脫、難于精確定量等。另外，ICAT標簽試劑本身的相對分子質量約為500，增加了譜圖和數據庫搜索的復雜性。為解決這些技術上的缺陷，先后又開發了可剪切ICAT（cleav?able ICAT，cICAT）試劑，用可被酸剪切的官能團代替ICAT試劑中的聚醚鏈接，以此減少難以解析的碎片離子數量；以9個13C取代8個氘原子，使輕、重同位素試劑相對分子質量相差9，不僅便于質譜分辨不同分子質量的標簽，而且使得輕、重肽段可被色譜共洗脫，有效提高了定量精度。Kohler等[41]用cICAT標記方法檢測了普通幼蟲期果蠅和饑餓狀態下的脂肪體蛋白質的表達變化，監測到脂肪脫氫酶Desat1缺失時果蠅幼蟲細胞在喪失饑餓狀態下的自我吞噬的功能，首次揭示了Desat1在脂滴形成和自體吞噬中的作用。這種cICAT標記試劑的缺點是合成成本太高，難以普及使用。

4.4 iTRAQ標記方法

iTRAQ標記是化學標記的一種，可同時標記并比較8種不同樣本，提高了分析通量。Pflieger等[42]使用iTRAQ技術對蛋白磷酸酶處理后果蠅細胞系進行研究，通過比較蛋白質的磷酸化狀態，發現了胰島素受體的同源序列Chico。Pedersen等[43]為了檢測果蠅中的溫度敏感致死因子，采用iTRAQ技術對實驗組、近交系對照組和遠交系對照組進行不同的化學標簽標記，經二維液相色譜-串聯質譜分析，共鑒定到45個在實驗組和近交系對照組發生了明顯變化的可能的溫度敏感蛋白，這些蛋白在近交系和遠交系對照組中并沒有發生顯著的量的變化，進一步證明了這些溫度敏感差異蛋白的真實性。但這種標記方法要求對比較的蛋白組必須進行提取、蛋白酶消化和脫鹽處理等多個步驟，然后才能進行標記、混合和質譜鑒定、定量。這會引入試驗誤差，增加了發現真實的生物學差異蛋白的難度。

4.5 無標定量方法

無標定量方法不進行任何標記，而是直接利用質譜鑒定中產生的數據，比如樣品酶切后經LC-MS/MS產生的質譜數據對蛋白樣品進行定量比較。這種方法簡便易行，在果蠅定量蛋白質組學研究上也得到了廣泛應用。Xun等[44]利用該方法分析了帕金森病果蠅模型的蛋白質組，在A53T α-突觸核蛋白果蠅模型中鑒定、定量了253個蛋白，并在重疊區域篩選到24個表達差異蛋白。這些蛋白主要與膜、內質網、肌動蛋白細胞骨架、線粒體和核糖體相關。Xun等[45]將無標定量和廣泛型內標技術相結合，定量了青少年型帕金森病果蠅模型（AR-JP），共定量了375個蛋白。其中16個蛋白具有顯著的表達差異，參與能量代謝的失調蛋白有7個，并有6個表達下調，說明青少年型帕金森病和能量代謝有較高的關聯性；參與蛋白轉運活動的5個蛋白均表現出較高的水平，如幼蟲血清蛋白1α、1β、1γ和脂肪體蛋白1均顯示出高于10倍的上調水平。盡管同位素標記已成為可信賴的定量方法，但準備同位素化合物需大量時間，并且試劑昂貴，難以推廣，而非標定量法不存在這些缺點，應用前景廣闊。但非標定量法對樣品制備和分析過程的控制要求較高，否則難以得到可信的結果。

5 果蠅疾病模型蛋白質組

近一個世紀以來，果蠅作為生命科學領域的一種理想的模式生物，在生物學研究的舞臺上占有舉足輕重的地位。十幾年前完成的果蠅的基因組測序結果顯示，超過60%的人類疾病基因在果蠅的基因組中有直系同源物，其中人類的腫瘤、神經疾病、畸形綜合征等相關基因多與果蠅基因同源。因此，以果蠅為模式研究人類疾病的發病機制有非常重要的意義[46]。

Xun等[47]利用液相色譜和質譜聯用技術，對A30P α-突觸核蛋白轉基因果蠅和對照的早期帕金森病果蠅模型進行了蛋白質組研究，結果顯示約44%的基因在轉錄水平和蛋白質水平均發生了改變，但變化趨勢不完全一致。蛋白質組研究彌補了轉錄本研究的不足，對后期疾病狀態的預測有較大的幫助。他們在該研究中還發現，早期的細胞骨架和線粒體差異蛋白主要與神經退化相關。

Beller等[49]比較了野生型和脂肪儲存缺陷型果蠅的脂肪滴成分的差異，在鑒定到的248個蛋白中，除了發現與脂肪滴相關的PAT蛋白外，還鑒定了參與蛋白質胞內定位和多層面轉運的一些相關蛋白。Li等[50]利用2-DE技術研究了經飲食抑制劑BBI處理后果蠅胚胎中腸蛋白質組的變化，發現了9種表達差異蛋白，例如固醇載體蛋白SCPX參與了脂肪酸代謝過程。脂滴和脂肪酸代謝直接介導肝臟脂質代謝，是肝病發生和發展的主要成因，這為人類肝臟疾病的研究提供了依據。

Chan等[51]利用果蠅模型研究了VCP基因引起的額顳葉癡呆病（IBMPFD）的比較蛋白質組。利用2D-DIGE方法在轉基因果蠅模型中鑒定了43個蛋白點，并發現VCP的突變消耗了大量ATP，為節約能量，導致肌動蛋白關閉，由此激活ROS信號通路，進而引發細胞凋亡。這是蛋白質組學在探索IBMPFD分子機制方面的新發現，為發病機理的研究和治療靶點的尋找提供了有力證據。

6 結語

利用果蠅進行遺傳學研究的歷史悠久，對其染色體組成、編碼基因、蛋白質定位和表型等的詳細闡明都是其他生物無法比擬的。百余年的研究也積累了很多果蠅的相關知識與信息，制備了大量分布于數以千計的基因中的突變體，為構建果蠅的各種疾病模型奠定了基礎。隨著蛋白質組學技術的發展，果蠅還將繼續作為重要的模式生物被廣泛用于生命科學的各個研究領域。這為開展與疾病相關的臨床蛋白質組學（clinical proteomics）研究，揭示生命的奧秘和疾病發生發展的分子機制奠定堅實的基礎。

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