結核分枝桿菌Rv3425蛋白的原核表達純化及其血清學診斷價值

孫衛國，李邦印，劉艷華，張靈霞，熊志紅，程小星

解放軍第309醫院 結核病研究所，北京 100091

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tu?berculosis，MTB）引起的慢性傳染病，目前死亡率仍然比較高。人群中絕大多數MTB感染為潛伏感染，MTB處于休眠狀態，在機體免疫力低下或伴隨其他感染時，休眠的MTB受激活引發結核病。結核病人的繼發感染成為結核病傳播和再發的重大隱患[1]。快速靈敏的診斷技術和規范有效的治療是控制結核病的關鍵[2]。結核病的臨床診斷有諸多方法，而基于特異性抗原的結核病血清學診斷快速具有特異性高、敏感性強、重復穩定性好的特點，操作簡便，可以肉眼判斷結果，有望成為結核病臨床診斷的首選方法。尋找一種高敏感性和高特異性的結核抗原成分，是利用血清學進行早期快速準確診斷的前提。結核分枝桿菌PPE蛋白家族是一類富含甘氨酸且為結核分枝桿菌特有的蛋白[3]，這類蛋白含有共同的Pro-Pro-Glu結構域，蛋白間沒有共同的作用位點，相互間沒有交叉反應[4]。Rv3425是PPE家族第3亞族的一個成員，由176個氨基酸殘基組成，為免疫顯性的B細胞目標抗原，為RD11區蛋白。生物信息學預測表明，Rv3425的19～176位殘基覆蓋了Rv3425全部的抗原指數較強的B細胞抗原決定簇[5]。

我們以結核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，常規PCR擴增Rv3425基因，獲得原核表達的重組Rv3425蛋白，探討了其免疫學活性及在檢測血清中抗結核抗體方面的應用價值，為研制更有效的結核病免疫診斷試劑及新型治療藥物奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

臨床診斷病人血清和健康人血清均由本所臨床檢驗室提供；大腸桿菌BL21（DE3）、結核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA、質粒pET-28a均系本室保存；內切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶和dNTP均購自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；酶標羊抗人IgG（HRP）購自中山生物工程技術公司；親和色譜填料購自Bio-rad公司；其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 引物設計

根據GenBank中的結核桿菌H37Rv株Rv3425基因序列（Gene ID：887635）設計合成特異性引物，在反向引物中將原有終止密碼子改為大腸桿菌偏性的TAA。上下游引物分別為P1（5'-GGAATTC?CATATGCATCCAATGATACCAGCGGAG-3'）和 P2（5'-CCGCTCGAGTTACCCGCCCCTGTAGATC-3'），下劃線序列分別為NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點。

1.3 pET-28a-Rv3425重組質粒的構建

以結核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，用引物P1、P2通過PCR擴增Rv3425核酸序列并回收PCR產物。用NdeⅠ和XhoⅠ酶切PCR產物，然后在T4DNA連接酶的作用下，把回收片段克隆到經同樣酶切的原核表達質粒pET-28a中，連接產物轉化感受態大腸桿菌BL21（DE3），篩選陽性克隆測序。

1.4 結核桿菌Rv3425蛋白的原核表達

將測序正確的工程菌接種含卡那霉素的LB培養基，37℃振搖培養至菌液D600nm達0.4時，立即加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，37℃繼續誘導7 h，離心收集菌體，按1∶10的比例將菌體溶于1×PBS緩沖液中，充分混勻，低溫條件下超聲波破碎，離心后收集上清和沉淀，進行14%的SDS-PAGE，分析目的蛋白的表達量和表達形式。

1.5 結核桿菌Rv3425蛋白的復性與純化

Rv3425蛋白以包涵體的形式存在，將包涵體先后用1%的Triton X-100和3 mol/L鹽酸胍交替洗滌，洗滌后的包涵體用含6 mol/L鹽酸胍、10 mmol/L β-巰基乙醇的TE緩沖液變性溶解，高速離心取上清，上清液以1∶50的比例和5 mL/h的速度滴加到復 性 液（25 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L GSSG，0.2 mmol/L GSH，pH8.0）中，4℃放置過夜，高速離心除去沉淀，在4℃條件下取上清過鎳離子親和柱，分別以50、150 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白和目的融合蛋白，收集穿過峰和洗脫峰蛋白，進行14%的 SDS-PAGE，分析純化的目的蛋白的純度，對純化的重組蛋白進行水透析后凍干保存。

1.6 結核桿菌Rv3425蛋白的免疫印跡分析

取純化的Rv3425蛋白，經SDS-PAGE后采用半干法轉到PVDF膜上，依次經5%脫脂奶粉封閉、3例臨床確診的結核病病人血清、HRP標記的羊抗人IgG孵育后，漂洗干凈，加入化學發光試劑，在ECL暗室中自動曝光顯影，初步分析Rv3425蛋白的抗原特異性。

1.7 結核桿菌Rv3425蛋白的人血清ELISA分析

用碳酸鹽緩沖液將Rv3425蛋白稀釋至1 μg/mL，酶標板每孔包被100 μL，室溫2 h，洗板5次后用30%的BSA于37℃封閉2 h，洗板5次，瞬時倒扣濾紙吸干；待測血清用PBS緩沖液稀釋至1/200，取100 μL加入反應孔，37℃溫箱放置1 h，洗板5次；每孔加入用PBS稀釋至1/1000的HRP標記的羊抗人IgG 100 μL，于37℃溫箱放置1 h，洗板5次，加入TMB顯色液，于37℃溫箱中反應30 min顯色，酶標儀檢測D450nm值，大于1.0為陽性。

2 結果

2.1 原核表達載體pET-28a-Rv3425的構建

以結核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，通過常規PCR方法擴增得到成熟Rv3425核酸序列。經1%瓊脂糖電泳，在約530 bp處獲得單一的電泳條帶（圖1）。將PCR片段經酶切后克隆至表達載體pET-28a中，轉化感受態大腸桿菌BL（DE3），篩選測序結果與預期完全一致的克隆。

2.2 結核桿菌Rv3425蛋白的原核表達

取測序正確的克隆菌落接種含卡那霉素的LB培養基，37℃培養至菌液D600nm為0.4時加入IPTG繼續誘導7 h，菌體經超聲破碎后進行SDS-PAGE，在相對分子質量20×103處有表達條帶，與Rv3425分子大小一致，表達量占細菌總蛋白的20%～25%，基本以包涵體形式存在于超聲波破碎后的細菌沉淀中（圖2）。

2.3 結核桿菌Rv3425蛋白的純化

圖1 凝膠電泳鑒定PCR擴增的Rv3425基因

將包涵體初步提純后，用6 mol/L鹽酸胍和10 mmol/L β-巰基乙醇變性，在配制的復性液中進行滴加復性，低溫過夜放置后高速離心除去沉淀。在4℃條件下取上清，用鎳離子親和柱純化，分別以50、150 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集穿過峰和洗脫峰蛋白進行14%的SDS-PAGE，分析純化的目的蛋白的純度，結果如圖3，純化后Rv3425蛋白的純度達90%以上，用水透析后凍干保存。

2.4 Western印跡鑒定Rv3425蛋白的抗原性

取純化后的Rv3425蛋白，用PBS緩沖液配制成1 mg/mL的儲存液，行14%的SDS-PAGE后轉移至硝酸纖維素膜上，封閉后，分別與3例強陽性人血清和6例健康人血清孵育，與HRP標記的羊抗人二抗結合反應，ECL暗室中自動曝光顯影，結果見圖4。Rv3425蛋白能與3例陽性血清結合，而與6例健康人血清的反應不明顯。Western印跡結果證實Rv3425具有較強的抗原性。

圖2 pET-28a-Rv3425原核表達產物的SDS-PAGE分析

圖3 SDS-PAGE分析親和純化的Rv3425蛋白

圖4 Western印跡分析重組蛋白Rv3425的抗原性

2.5 ELISA分析

實驗表明最佳重組抗原包被濃度為1 μg/mL，血清稀釋度為1∶200。以復性純化后的Rv3425蛋白抗原分別對60份陽性血清和40份陰性血清進行檢測，其中陽性血清檢出30例，檢出率為50%；健康人血清檢出2例，檢出率為5%，特異度為95%。結核病人組的陽性率明顯高于對照組健康人。ELISA結果說明，重組蛋白Rv3425可作為待選抗原，用于結核病人的血清學診斷。

3 討論

目前臨床采用的結核桿菌細菌學診斷方法檢出率低、培養耗時長，很難滿足檢測需要。血清學檢測具有簡單、快速的特點，一直是臨床結核分枝桿菌診斷研究的重點，但至今未找到理想的靶抗原[6]。Rv3425是由結核桿菌RD11區編碼的PPE蛋白家族成員，僅存在于致病性結核分枝桿菌中，作為診斷抗原在結核病臨床診斷方面有廣闊的應用前景[7]。在本研究中，我們用大腸桿菌表達系統獲得的重組Rv3425蛋白具有較強的抗原性，對60例陽性患者血清的總體檢出率達到50%。使用單一抗原時陽性檢出率往往都比較低，目前還沒有一種結核抗原能夠全部檢測出陽性血清。研究發現，采用CFP10-ES?AT6-Rv3425融合抗原可以提高結核桿菌檢出率，同時將多個單獨監測抗原聯合用于結核病的血清診斷可獲得較高的陽性檢出率[8]。綜上，我們得到了高純度重組Rv3425蛋白，為今后開發能區別結核感染狀態的血清學鑒別診斷試劑，及針對結核分枝桿菌感染者的治療性疫苗的候選抗原打下了基礎。

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