甲基營養菌MP688胞外多糖合成的影響因素研究

葛欣 ，韓月梅 ，，熊向華 ，汪建華 ，劉黨生 ，張惟材

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；2.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016

合成分泌胞外多糖是許多微生物具有的一種能力，特別是在致病菌和根瘤菌中更常見[1]。胞外多糖是一種相對分子質量不定的單糖多聚物，包括附著在細胞表面的脂多糖和莢膜多糖，以及釋放到胞外環境中的可溶性多糖[1-2]。微生物合成的胞外多糖具有多種生理功能，如保護其免受環境壓力的損傷、防止細胞脫水、免疫響應等[3]。除此以外，微生物合成的胞外多糖在食品、添加劑和生物醫藥等方面還具有重要的應用價值[4-5]。因此，有關微生物合成多糖的研究意義重大。

甲基營養菌是能夠以甲醇為惟一碳源生長并合成多種代謝產物的一類細菌，已有文獻報道甲基營養菌能夠分泌胞外多糖[6]。在工業生產中，甲醇成本低廉且來源廣泛，因此通過微生物的一碳代謝途徑來生產食品添加劑、氨基酸、輔酶和其他藥物前體具有很大潛力[7]。MP688是本實驗室從土壤中分離到的一株好氧甲基營養菌，曾用來發酵合成吡咯喹啉醌。基因組測序結果表明，MP688中含有一個胞外多糖合成的基因簇，具有合成多糖的潛力[8]。改變培養條件后發現該菌在以甲醇為碳源生長時也能分泌較高水平的莢膜多糖和可溶性多糖，因此MP688有望成為一株具有多糖生產潛力的工業菌。

為了提高甲基營養菌MP688的胞外多糖合成能力，使之最終成為一株具有生產多糖的菌株，對MP688發酵培養過程中影響多糖合成的因素進行研究，進而找到突破口至關重要。在本研究中，我們首先通過一系列單因素實驗考察了不同氮源、培養溫度、培養基初始pH值和通氧量等條件對MP688合成胞外多糖的影響，確定了每個因素的最適范圍；進而通過Plackett-Burman實驗篩選到MP688合成多糖的最主要影響因子，為進一步優化多糖合成的條件奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

甲基營養菌MP688（Methylovorus sp.MP688）由本實驗室保存，30℃恒溫培養，搖床轉速200 r/min。

基礎培養基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，KH2PO41.4 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，檸檬酸鐵 0.03 g/L，CaCl20.03 g/L，MnCl2·4H2O 0.005 g/L，ZnSO4·7H2O 0.005 g/L，CuSO4·5H2O 0.005 g/L。初始pH值為6.5，115℃滅菌30 min。單因素考察時根據條件分別替換基礎培養基中的氮源、改變初始pH值、改變培養溫度。

所有試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司，為分析純級別。

1.2 Plackett-Burman設計

在Plackett-Burman實驗設計中，我們將MP688合成多糖時所用的培養基組分和培養條件共8個因素作為考察變量（X1～X8），每個變量設置2個水平，分別為高水平（-1）和低水平（+1）。為了對實驗結果進行誤差分析，分別設置 3 個虛擬變量（X9～X11）[9]。實驗設計見表1，共12組實驗，每組實驗中細菌培養5 d后測定發酵液中的多糖含量。將12組實驗結果和8個變量根據以下方程進行線性回歸：

其中Y為多糖含量，β0為線性回歸方程的截距，βi為每個變量的系數，Xi為每個變量的實際水平。

1.3 統計學分析

圖1 甲基營養菌MP688在6種不同氮源條件下多糖的合成量

實驗設計、結果計算和方差分析等都采用De?sign-Expert軟件完成。通過計算相關系數（R2）評估多元線性回歸的結果，通過F檢驗和t檢驗評估結果的統計學顯著性[10]。

1.4 胞外多糖測定方法

在不同條件下將MP688培養5 d，收集100 mL培養物，12 000 r/min、4℃離心 10 min，收集上清液，加入2倍體積的低溫預冷的無水乙醇，放置10 min后12 000 r/min、4℃繼續離心 10 min，收集沉淀，用無水乙醇洗滌2次，加入10 mL去離子水溶解，用苯酚-硫酸法測定多糖含量[7]，每組數值測定3次，計算平均值和標準差。

2 結果

2.1 氮源對MP688胞外多糖合成的影響

由于甲基營養菌MP688在以甲醇為碳源的培養基中生長最好，因此碳源種類對多糖的合成不做研究。為考察培養基中氮源成分對多糖合成的影響，我們將等量種子液分別接種到以1.5%的硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀、胰蛋白胨和尿素為惟一氮源的培養基中，30℃培養5 d后測定發酵液中的多糖含量，結果見圖1。用于研究MP688合成吡咯喹啉醌的氮源是硫酸銨，并不是多糖合成的最優氮源；當硝酸鈉和硝酸鉀作為氮源時多糖含量高，72 h后的多糖產量均在400 mg/L以上；而2種測定的有機氮源胰蛋白胨和尿素都不利于多糖的大量合成。

2.2 培養溫度對MP688胞外多糖合成的影響

為了研究溫度對甲基營養菌MP688合成多糖的影響，我們將等量種子液接種到初始pH值為6.5的以1%甲醇為碳源、1.5%硝酸鈉為氮源的培養基中，30℃培養5 d后測定發酵液中的多糖含量，結果見圖2。20℃和25℃均不利于MP688合成多糖，而30℃和37℃條件下多糖合成能力較高。

2.3 初始pH值對MP688胞外多糖合成的影響

圖2 甲基營養菌MP688在不同培養溫度條件下多糖的合成量

為了研究培養基初始pH值對甲基營養菌MP688合成多糖的影響，我們將等量種子液接種到初始pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的以1%甲醇為碳源、1.5%硝酸鈉為氮源的培養基中，30℃培養5 d后測定發酵液中的多糖含量，結果見圖3。初始pH值過高或過低都不利于細菌合成多糖，而初始pH值為6.5～7.0時多糖合成能力最強。這說明初始pH值是影響多糖合成的一個重要因素，對多糖合成有利的pH值范圍較窄。

2.4 通氧量對MP688胞外多糖合成的影響

為了研究通氧量對甲基營養菌MP688合成多糖的影響，我們將等量種子液接種后，在含100 mL培養基的250 mL搖瓶中，于不同轉速的搖床上培養5 d后測定胞外多糖含量，結果見圖4。隨著搖床轉速的提高，MP688合成的多糖量增加，當搖床轉速為250 r/min時多糖合成量高達445 mg/L，而轉速繼續提高后多糖合成水平下降。說明多糖合成是一個需氧的過程，轉速過低時通氧量低，不能滿足細菌生長和多糖合成需求，但轉速高于250 r/min時，可能由于剪切力過大導致MP688合成多糖的能力下降。200～250 r/min是合成多糖的最適轉速。

2.5 利用Plackett-Burman設計篩選影響胞外多糖合成的重要因素

圖3 甲基營養菌MP688在不同初始pH值條件下多糖的合成量

以上單因素研究結果表明，考察的因素對MP688合成多糖能力的影響程度和影響范圍有很大不同。為了系統地研究發酵過程中每個因素對多糖合成的影響程度及最顯著因素，我們進行了Plack?ett-Burman實驗設計，通過統計學方法考察每個因素的影響力度。分別選取甲醇、硝酸鈉、初始pH值、培養溫度、接種量、磷酸鹽濃度、搖床轉速、搖瓶體積等8個因素作為變量，每因素取2水平，設計12組條件，以每組條件實驗測定的多糖含量作為響應值，如表1所示；將變量與結果進行線性回歸和方差分析，如表2所示。回歸模型的P值為0.0241，說明8個變量的水平選取合適，結果差異明顯，回歸方程具有顯著性。其中，方程的相關系數R2為0.9755，說明我們實驗中得到的響應值的變異可被該模型合理解釋。從結果可知，在95%的概率水平上，甲醇、硝酸鈉、初始pH值和接種量等4個因素的P＜0.05，說明差異顯著，而其他4個因素的差異不具顯著性。這說明甲醇、硝酸鈉、初始pH值和接種量是MP688合成多糖的主要影響因子，影響程度依次為甲醇含量＞培養基初始pH值＞接種量＞硝酸鈉含量。

2.6 胞外多糖合成量與影響因素的線性回歸曲線

通過對實驗結果進行多元線性回歸，得到多糖產量與8個因素之間的關系：

Y（mg/L）=800.10+425.33X1+74.00X2+141.00X3+10.71X4+116.67X5-9.50X6+0.11X7+0.27X8

其中，Y為多糖產量，X1～X8依次為甲醇、硝酸鈉、初始pH值、培養溫度、接種量、磷酸鹽濃度、搖床轉速和搖瓶體積。由方程中各因素的系數可知，除磷酸鹽濃度外，其他7個因素對MP688合成多糖均為正效應。

圖4 甲基營養菌MP688在不同搖床轉速條件下多糖的合成量

表1 Plackett-Burman實驗設計及結果

表2 Plackett-Burman實驗結果的統計學分析

3 討論

本研究首先考察了單因素對甲基營養菌MP688合成胞外多糖的影響。其中，胞外多糖合成的最優氮源為硝酸鈉，其次是硝酸鉀，在這2種條件下細菌生長旺盛，多糖也能快速大量合成；最差氮源為氯化銨，可能是由于其影響細菌生長，也有可能是氯化銨消耗后發酵液pH值變化劇烈；含氮有機物為遲效氮源，培養初期釋放慢，可能不能滿足MP688生長需要，因此合成的胞外多糖量也有所降低。合成多糖的pH值為中性，可能酸性或堿性條件影響多糖的分泌。通氧量是多糖合成的重要因素，說明細菌合成多糖過程中代謝旺盛，能量需求較高。

除此以外，我們還通過Plackett-Burman實驗設計及統計學分析篩選到4個主要影響因子，分別為甲醇、硝酸鈉、初始pH值和接種量。碳源和氮源是維持細菌生長的必要因素，也是構成胞外多糖骨架的成分，其中甲醇和硝酸鈉對MP688胞外多糖合成的貢獻比例分別高達40.03%和10.9%，也說明了這2個因素的重要性。初始pH值可能主要影響多糖的分泌和大分子結構的穩定性，而接種量直接影響細菌的生長量，從而對胞外多糖含量影響較大。

Plackett-Burman實驗設計是一種經濟有效的量水平試驗設計方法，可通過最少的試驗次數達到使因素的主效果得到盡可能精確估計的目的，從而從眾多考察因素中快速有效地篩選出最重要的幾個因素，為進一步優化條件和提高產量提供依據[9-10]。本項研究成功地應用了這種實驗設計方案，達到了預期目的。

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