敲低GATA1慢病毒表達載體的構建及敲低效果檢測

張亞楠，劉婕，林婭紅，周蕾，丁麗華，葉棋濃

軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850

GATA1是轉錄因子GATA蛋白家族成員，1991年被首次發(fā)現(xiàn)報道。GATA1可以與［T/A（GATA）A/G］序列結構特異結合，隨后GATA2～GATA6逐一被報道，形成GATA家族。GATA1是造血系統(tǒng)特有的轉錄因子，為正常紅細胞發(fā)育所必需，不僅存在于紅系細胞中，在巨核細胞系和肥大細胞系中也有很高的含量[1-2]。GATA1調(diào)控紅細胞的分化和成熟，在巨核細胞分化發(fā)育過程中具有多功能性，可影響細胞生長發(fā)育和成熟。同時，GATA1的點突變可導致白血病的發(fā)生，GATA1與伴有嚴重貧血的多發(fā)性骨髓瘤也有密切關系[3]。由此可見，GATA1在造血細胞系中有很高的含量，與很多血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，也與人類身體健康息息相關[4]。我們的研究表明，GATA1在除了造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)細胞中表達外，在其他類型的細胞中（如本文的人胚腎細胞）也有表達，提示GATA1在實體腫瘤中也有作用。由于GATA1在實體瘤中的作用只在乳腺癌中有所報道，因此深入研究GATA1在實體腫瘤中的功能及其分子機制具有十分重要的意義。

我們用構建慢病毒載體的小發(fā)夾RNA（shRNA）技術抑制GATA1的表達，與普通轉染方法相比能獲得更高的感染效率，以便為GATA1的后續(xù)研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎293T細胞由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、轉染試劑LipofectAMINE 2000、TRIzol均購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司；慢病毒表達載體購自SBI公司，包含pSIH1-H1-Puro載體和pPack Packaging Plasmid Mix載體；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、反轉錄酶、實時定量PCR試劑均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；兔抗人GATA1抗體購自Abcam公司；兔抗人GAPDH和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG均購自Santa Cruz公司；引物由北京賽百盛生物有限公司合成；質(zhì)粒測序分析由北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成；實時定量PCR儀為ABI PRISM 7000型。

1.2 shRNA慢病毒載體的構建

根據(jù)shRNA靶序列篩選設計原則，結合人GATA1的基因序列和網(wǎng)站分析，選擇確定一條特異性shRNA靶序列。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對確定的靶序列進行Blast分析，證明與其他已知基因沒有同源性，然后設計合成寡核苷酸的正義鏈和反義鏈進行退火處理，即先將其分別溶于雙蒸水中，等摩爾數(shù)混合后95℃加熱5 min，自然降溫至37℃，形成雙鏈的寡核苷酸。將退火的shRNA序列插入經(jīng)酶切的pSIH1-H1-Puro載體，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆測序驗證。GATA1 shRNA的上游序列為5'-TAGTG CTTATGGGGGCCCTGACTTT-3'，下游序列為5'-AA AGTCAGGGCCCCCATAAGCACTA-3'。

1.3 質(zhì)粒瞬時轉染293T細胞

細胞用含10%新生牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，用不含雙抗、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將人胚腎293T細胞接種于12孔板中，接種量以轉染時細胞密度達到80%為宜，培養(yǎng)24 h后進行轉染。將總量2 μg的質(zhì)粒與50 μL無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基混合，再將1 μL Vigorous與50 μL無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入12孔板中，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)48 h后收獲細胞。

1.4 Western印跡

人胚腎293T細胞轉染48 h后收集細胞，加入SDS-PAGE加樣緩沖液，煮沸15 min，離心后取上清液進行SDS-PAGE，電泳結束后轉移至硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，然后用以5%脫脂奶粉稀釋的抗GATA1多克隆抗體室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次6 min；加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次6 min；用化學發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.5 細胞RNA提取和RT-PCR檢測

轉染48 h后收集人胚腎293T細胞，加入TRIzol提取細胞總RNA，取2 μg進行反轉錄，得到cDNA第一鏈，以之為模板，用實時定量PCR儀分別擴增GATA1 cDNA［引物為 Forward（5'-TGGAGACTTTG AAGACAGAGCGGCTGAG-3'）和 Reverse（5'-GAAG CTTGGGAGAGGAATAGGCTGCTGA-3'）］和 β-actin內(nèi)參基因［引物為Forward（5'-ATCACCATTGGCA ATGAGCG-3'）和 Reverse（5'-TTGAAGGTAGTTTC GTGGAT-3'）］，并收集熒光信號，用 2-ΔΔCt方法進行基因相對表達分析。

2 結果

2.1 GATA1 siRNA慢病毒載體的構建

將合成的2條引物進行退火處理后，將退火產(chǎn)物和2條引物一起進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1），結果顯示退火產(chǎn)物的條帶水平位置位于2條引物的上方，證明退火成功。轉化后挑取GATA1 siRNA慢病毒載體克隆，DNA測序結果顯示GATA1 siRNA序列已插入pSIH1-H1-Puro載體，序列與預期完全一致（圖2），證明GATA1 siRNA表達載體構建成功。

2.2 GATA1 siRNA對GATA1基因表達的影響

圖1 GATA1 siRNA退火結果

圖2 GATA1 siRNA慢病毒載體的測序結果

在有內(nèi)源性GATA1表達的293T細胞中，分別轉染GATA1 siRNA及對照siRNA，48 h后收集蛋白，用GATA1抗體進行Western印跡（圖3）。結果表明，與對照組相比，GATA1 siRNA能明顯抑制內(nèi)源性GATA1的表達，而同時用GAPDH抗體檢測并沒有明顯的改變。由此可見，所設計的GATA1 siRNA能夠有效降低GATA1基因的表達。

2.3 GATA1 siRNA對GATA1基因轉錄水平的影響

在有內(nèi)源性GATA1表達的293T細胞中，分別轉染GATA1 siRNA及對照siRNA，48 h后收取細胞提取細胞總RNA，利用RT-PCR鑒定GATA1 siRNA的抑制效果（圖4）。RT-PCR結果表明，與對照組相比，GATA1 siRNA轉染組的mRNA水平顯著降低，說明構建的GATA1 siRNA能夠有效抑制293T細胞GATA1基因的轉錄水平。

圖3 Western印跡檢測GATA1 siRNA的敲低效果

圖4 RT-PCR檢測GATA1 siRNA的敲低效果

3 討論

RNA干擾（RNAi）是近年發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種古老的生物學現(xiàn)象，是由雙鏈RNA介導的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。慢病毒載體是源于人免疫缺陷病毒1（HIV-1）的一種病毒載體，包含了包裝、轉染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。攜帶外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細胞或活體組織，實現(xiàn)外源基因在細胞或活體組織中的表達。將慢病毒載體作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性的使基因表達沉默的能力，還能充分發(fā)揮自身所具備的優(yōu)勢。實驗證實，我們所構建的GATA1 siRNA慢病毒表達載體具有顯著的干擾效果。

轉錄因子GATA1在正常紅細胞增殖、分化過程中起重要的生物學作用，且控制著巨核細胞、肥大細胞核嗜酸性細胞的分化。GATA1可以和許多生物大分子相互作用[5]，在血小板減少癥、多發(fā)性骨髓瘤、白血病等疾病中發(fā)揮重要的生物學效應[6-7]。實驗證實，我們構建的GATA1 siRNA慢病毒表達載體可以降低GATA1基因的表達水平，同時也能有效抑制GATA1的轉錄水平。GATA1作為一個潛在的癌基因，在諸多血液疾病中發(fā)揮重要作用，可能成為腫瘤基因治療的靶標[8-9]。但是，GATA1在實體腫瘤中的作用還很不清楚。綜上，GATA1 siRNA慢病毒載體的成功構建，為進一步研究GATA1多方面的功能打下了堅實的基礎。

[1]Joan B,Peter B,Yoshihiro N,et al.Regulation of activity of the transcription factor GATA-1 by acetylation[J].Nature,1998,396(6711):594-598.

[2]馮雪梅，祝彼得.GATA-1的研究現(xiàn)狀[J].四川醫(yī)學,2006,27(2):132-134.

[3]吳秀麗,李揚秋.轉錄因子GATA-1在造血系統(tǒng)中的作用（綜述）[J].暨南大學學報（醫(yī)學版）,2002,23(6):21-26.

[4]Benjamin D,Joanna K,Laura G,et al.Vegf regulates embry?onic erythroid development through Gata1 modulation[J].Blood,2010,116(12):2141-2151.

[5]Christiane L B,Milton A E,Jagman C,et al.Differential re?quirement for Gata1 DNA binding and transactivation between primitive and definitive stages of hematopoiesis in zebrafish[J].Blood,2009,114(25):5162-5172.

[6]Boidot R,Vegtan F,Jacob D,et al.The transcription factor GATA-1 is overexpressed in breast carcinomas and contrib?utes to survivin upregulation via a promoter polymorphism[J].Oncogene,2010,29(17):2577-2584.

[7]Rena Z,Gerd A.GATA transcription factors and cancer[J].Genes Cancer,2011,1(12):1178-1188.

[8]Rita F,Kinuko O,Masayuki Y,et al.GATA1 function,a par?adigm for transcription factors in hematopoiesis[J].Mol Cell Bi?ol,2005,25(4):1215-1227.

[9]Wendy A C,Wendy H R,Melissa A K.Human phenotypes associated with GATA-1 mutations[J].Genes,2008,427(1-2):1-6.