靶向c-Raf-1基因的反義核酸抗乙型肝炎病毒活性研究

黃海 ，張秀娟 ，謝佩雯 ，王學軍 ，王升啟

1.河南中醫學院，河南 鄭州 450003；2.軍事醫學科學院 放射與輻射醫學研究所，北京 100850

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染嚴重影響人類健康。目前，治療乙肝病毒的藥物主要有2大類，即干擾素和核苷類似物，但這2類藥物仍然存在不同程度的副作用且均不能徹底清除HBV，尤其對HBV表面抗原（hepatitis B surface protein，HBsAg）的清除作用微弱，而HBsAg的表達是造成HBV免疫耐受的關鍵因素之一[1]。因此，尋找能抑制HBsAg的藥物將是未來抗HBV治療的重中之重。

尋找病毒和宿主之間的相互作用關系并發現有效的抗病毒藥物靶點，是當前病毒學研究的重點和熱點，治療方法從傳統的靶向病毒向靶向宿主基因發展已成為一種新趨勢，并且在許多抗病毒治療探索中均取得了重要進展[2-5]。HBV感染是引起人類肝細胞癌的重要潛在致病因子。HBV基因組中具有轉錄激活活性的HBx蛋白，可引發c-Raf-1/MEK激酶級聯反應[6]，促進HBV的表達，致使細胞增殖周期失調，進而形成腫瘤。眾多研究數據表明，宿主基因c-Raf-1參與了HBV在肝細胞內的復制[7]，并且c-Raf-1的活化在肝癌的發展中也起重要作用[8]。這就提示我們c-Raf-1基因可能是抗HBV藥物設計的潛在作用靶點，抑制c-Raf-1可能起到抗HBV復制及其疾病進程的作用。

反義核酸（antisense oligonucleotide）是根據堿基互補原理，利用一段特異互補的DNA或RNA片段抑制或封閉特定基因表達的一門技術，是在mRNA水平干擾基因功能，開發新藥的一種方法[9]。我們通過設計并篩選能特異性抑制c-Raf-1基因的反義核酸，驗證通過干擾c-Raf-1基因的功能是否具有抑制HBV表達的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

4～5周齡C57/BL6雄性小鼠購自軍事醫學科學院動物實驗中心；HBV穩定轉染細胞HepG2.2.15由本實驗保存，在含10%胎牛血清（FBS，Hyclone公司）、380 μg/mL G418的DMEM細胞培養液［M&C Gene Technology（Beijing）Ltd.］中，于 37℃、5%CO2條件下培養；GenJet Ver.II轉染試劑購自SignaGen公司；HBsAg及乙肝e抗原（HBeAg）定性檢測試劑盒購自上海科華有限公司；HBsAg及HBeAg定量檢測試劑盒購自北京泰格有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自日本同仁化學研究所（Dojin?do）；反轉錄試劑盒購自北京天根生化科技公司；TRIzol購自Invitrogen公司。

1.2 靶向c-raf-1基因反義核酸的設計

根據GenBank中人和小鼠c-raf-1基因mRNA序列（人：NM_002880；小鼠：NM_029780）的同源區，用 Antisense Design軟件（http://sfold.wadsworth.org）進行基于RNA二級預測結構的計算機輔助反義核苷酸設計，通過GenBank聯機BLAST比對，保證所選擇的靶序列具有較好的特異性，設計并合成3條靶向 c-raf-1 的反義核苷酸 Raf-565（5′-TTGCTTGTC TTAGAAGGATC-3′）、Raf-943（5′-TAGTAGGTACT TTGGTGCTA-3′）和 Raf-3145（5′-AAACCTGTATT CCTGGCTTC-3′）。

1.3 脂質體介導瞬時轉染寡核苷酸

將生長狀態良好的HepG2.2.15細胞分別按7×103/孔接種于96孔板，每個實驗組設置3個重復孔。細胞于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養12～24 h，待細胞達到60%～70%融合時，參照SignaGen公司GenJet Ver.II轉染試劑操作說明進行轉染，將脂質體和寡核苷酸按3∶1的體積質量比混勻，每孔轉染的反義核酸體積為 100 μL，終濃度為 0.4 μmol/L。同時設立轉染試劑對照組，轉染8 h后去除含脂質體-寡核苷酸的轉染液，用含10%FBS的DMEM正常培養液繼續培養，轉染96 h后收集細胞培養液，檢測HBsAg和HBeAg的表達。

1.4 細胞上清HBsAg和HBeAg的檢測

收集細胞上清，按照HBsAg和HBeAg的ELISA檢測試劑盒說明書操作步驟進行。即取50 μL細胞培養液加入包被有HBsAg或HBeAg抗體的96孔板中，每孔加入50 μL的HBsAg或HBeAg對應的酶標結合物，封板，振蕩混勻，于37℃溫箱孵育30 min，手工洗板5次，加入顯色液A和B，封板，振蕩混勻，于37℃溫箱孵育15 min，加終止液50 μL，振蕩混勻，酶標儀上測定D450nm值。

1.5 反義核酸細胞毒性檢測

分 別 以 0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L 的 濃 度 轉 染HepG2.2.15細胞，每個藥物做3個復孔，同時設立轉染試劑對照組（按最高劑量），參照SignaGen公司GenJet Ver.II轉染試劑操作說明進行轉染，將脂質體和寡核苷酸按3∶1的體積質量比混勻，每孔轉染的反義核酸體積為 100 μL，終濃度為 0.4 μmol/L。轉染8 h后換正常細胞培養液（含10%FBS的DMEM細胞培養液）繼續培養，轉染96 h后按照CCK-8說明書檢測反義核酸的細胞毒性，細胞加入CCK-8后于37℃孵育箱中孵育0.5～1 h，酶標儀上測定D450nm值。

1.6 RT-PCR檢測c-Raf-1基因mRNA水平

反義核酸 Raf-3145分別以 0.4、0.8、1.6 μmol/L的濃度轉染HepG2.2.15細胞，并設正義序列（1.6 μmol/L，5′-TTTGGACATAAGGACCGAAG-3′）、隨機序 列（1.6 μmol/L，5′-CGGTACAGCCGTTCAATCG A-3′）和轉染試劑對照組（按最高劑量）。轉染8 h后換正常細胞培養液（含10%FBS的DMEM細胞培養液），37℃、5%CO2繼續培養。轉染96 h后用TRIzol RNA提取試劑盒提取HepG2.2.15細胞總RNA，并取 1～2 μg RNA 作為模板，加入 2 μL 5×cDNA緩沖液及無RNase的ddH2O 6 μL，于42℃孵育 3 min，再將其與 2 μL 10×Fast RT 緩沖液、1 μL RT Enzyme Mix和2 μL RQ-RT Primer Mix混合，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，得到cDNA。參照GenBank中人c-Raf-1的基因序列設計PCR引物進行擴增，同時以GAPDH作為內參對照。c-Raf-1基因上游引物為5′-AAGATGCCGTGTTTG ATGGC-3′，下 游 引 物 為 5′-ATCCTGGAAACAGAC TCTCG-3′；GAPDH 上 游 引 物 為 5′-GCGGGAAATC GTGCGTGACATT-3′，下游引物為 5′-GATGGAGTT GAAGGTAGTTTCGTG-3′[10]。 PCR 反 應 體 系 包 括2.5 ng cDNA，Taq酶（TaKaRa公司）0.25 μL，10×PCR緩沖液5 μL，dNTP混合液4 μL，上、下游引物各 1 μL，滅菌蒸餾水 35 μL。PCR 反應條件：94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環。取PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 反義核酸體內藥效學評價

取4～5周齡C57/BL6雄性小鼠50只，每只尾靜脈注射相當于體重10%的PBS和6 μg pHBV1.18質粒[11]，在 5～8 s內注射完畢，2 d 后檢測 HBsAg和HBeAg的表達，并分為模型對照組和3個給藥組（劑量分別為 30、10、3 mg/kg），每組10只；腹腔注射隔天給藥，給藥容積0.2 mL，對照組注射0.2 mL PBS，檢測體重變化；分別于第 2、8、14、21、28、42 d尾靜脈取血，取 10 μL 血與 190 μL PBS 混勻，5000 r/min離心5 min取上清，定量檢測HBsAg和HBeAg的含量。按化學發光檢測試劑盒說明書步驟進行操作，取已離心上清50 μL加入已包被有HBsAg或HBeAg抗體的96孔板中，每孔再加入50 μL酶標結合物，封板，振震蕩混勻，于37℃溫箱中孵育30 min，手工洗板5次，加入發光液A和B，封板，避光，振蕩混勻，酶標儀檢測發光值。

1.8 做圖及統計學分析

用軟件Graph Pad Prism 5做圖，進行統計分析，數據以x±s表示，假設檢驗采用t檢驗或方差分析，P值以星號表示（***為P＜0.001，**為P＜0.01，*為P＜0.05）。

2 結果

2.1 靶向c-Raf-1的反義核酸抗HBV篩選

以0.4 μmol/L劑量轉染反義核酸至HepG2.2.15細胞，ELISA檢測細胞上清中的HBsAg和HBeAg表達水平，結果見圖1，反義核酸Raf-3145對HBsAg具有較好的抑制作用。

2.2 反義核酸Raf-3145抗HBV的劑量依賴關系

分別將反義核酸Raf-3145以0.2、0.4、0.8和1.6 μmol/L的劑量轉染HepG2.2.15細胞，正義序列與反義序列劑量為1.6 μmol/L，考察Raf-3145抑制HBV的劑量依賴關系，ELISA方法檢細胞上清中HBsAg和HBeAg水平，結果顯示Raf-3145對HBsAg的表達具有一定的抑制作用，并和劑量呈正相關（圖2）。

圖1 反義核酸對HepG2.2.15細胞上清HBsAg、HBeAg表達的抑制作用

2.3 反義核酸Raf-3145對HepG2.2.15細胞的毒性檢測

分別將反義核酸 Raf-3145 以 0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L的劑量轉染HepG2.2.15細胞，8 h后換液正常培養，并于轉染96 h后加入CCK-8，于37℃、5%CO2孵育箱中孵育0.5～1 h，于酶標儀上檢測D450nm值，結果顯示當給藥濃度在3.2 μmol/L時細胞稍顯毒性（圖3）。

2.4 RT-PCR檢測反義核酸Raf-3145對c-Raf-1基因mRNA水平的抑制作用

分別將反義核酸Raf-3145以0.4、0.8和1.6 μmol/L的劑量轉染HepG2.2.15細胞，正義序列與反義序列濃度為1.6 μmol/L，8 h后換液正常培養，并于轉染96 h后提取細胞總RNA，濃度結果顯示細胞總RNA純度較好（D260nm/D280nm為1.8～2.0），瓊脂糖凝膠電泳結果顯示無降解。取等量的總RNA 1 μg，按要求進行RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，Raf-3145對HepG2.2.15細胞中靶基因c-Raf-1的抑制效果比較明顯，并呈現一定的劑量依賴關系（圖4）。

圖2 Raf-3145對HepG2.2.15細胞上清HBsAg和HBeAg表達抑制的劑量依賴關系

圖3 CCK-8檢測反義核酸對HepG2.2.15細胞的毒性作用

圖4 Raf-3145對HepG2.2.15細胞內c-Raf-1基因mRNA水平的抑制作用

2.5 反義核酸Raf-3145抗HBV體內藥效學評價

利用HBV小鼠水動力模型評價了反義核酸Raf-3145的體內抗HBV活性，ELISA定量檢測結果表明只有Raf-3145高劑量組對HBsAg呈現出較明顯的抑制作用，其他組對HBsAg和HBeAg的抑制作用不明顯，個別時間點還呈現了一定的促進作用（圖5）。與對照組比較，各給藥組均無明顯的體重下降趨勢；解剖結果肉眼未見明顯器質性病變，表明在該劑量范圍內未見明顯毒性（圖6）。

圖5 反義核酸Raf-3145對小鼠血清中HBsAg、HbeAg表達的抑制作用

圖6 反義核酸Raf-3145對小鼠體重的影響

3 討論

Raf激酶有3種不同亞型，即Raf-1/c-Raf-1、Raf-A和Raf-B。Raf-A和Raf-B表現出獨特的組織表達形式，但c-Raf-1的表達更廣泛[12]。目前，對于HBV是如何調節c-Raf-1表達的機制還不是很清楚，但有研究顯示，HBV能通過增強Raf-1啟動子的活性，提高其在HepG2.2.15細胞中的表達[13]。以往研究c-Raf-1在肝細胞肝癌組織中的表達多數與Raf1/MAPK信號通路的激活有密切關系，且c-Raf-1在此過程中起重要作用[14]。HBV轉錄激活的2種蛋白均可引發該通路的激活，HBV的X蛋白更是與肝癌的發生、發展有著密切關系[15]。另外，c-Raf-1還與其他多種癌癥的發生、發展相關[3，16-19]。c-Raf-1作為癌癥治療的靶點已有相關報道，Kasid等證明用特異反義核酸ISIS-5132干擾c-Raf-1基因后，能夠抑制無胸腺小鼠體內的人類肺、卵巢及乳腺腫瘤異種移植物的生長[20]，并首次證明了c-Raf-1基因是抗癌癥研究中有效的靶點；還有研究顯示用脂質體介導轉染的靶向c-Raf-1的反義核酸可明顯抑制卵巢癌細胞c-Raf-1蛋白的表達[21]。

當前治療乙肝的藥物主要靶向病毒自身，容易產生耐藥性，靶向HBV復制必需的宿主基因有望解決這一問題。c-Raf-1在HBV復制過程中的機制雖不是很清楚，但其在HBV復制中的關鍵角色卻是確定的。本研究的新穎之處在于首次利用反義技術設計靶向宿主基因c-Raf-1的反義核酸，探討c-Raf-1作為抗HBV靶點的有效性。為了便于體內外同步篩選驗證，我們選擇的靶序列為人鼠同源序列，同時盡量避免脫靶效應。體內外結果顯示Raf-3145對HBsAg的表達表現出較好的抑制作用。考慮到c-Raf-1基因參與了HBV的復制過程，且有研究顯示c-Raf-1在肝癌患者體內的表達與HBV有關[13]，因此靶向c-Raf-1的藥物不但可抑制HBsAg的表達，有利于打破免疫耐受，而且可能延緩HBV導致的肝癌發展進程，具有重要的研究和開發價值。

綜上所述，本研究篩選并證實靶向基因c-Raf-1的反義序列Raf-3145具有一定的抑制HBsAg表達的活性，進而驗證了靶基因c-Raf-1的可靠性。考慮到反義序列Raf-3145具有的潛在開發價值，值得對其進行進一步的藥效學和毒性研究。

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