RP-HPLC、UV及容量法測定甲硝唑的含量

張 娜，徐 強，周 娟

（1黃山學院 化學化工學院，安徽 黃山 245041；2黃山食品藥品檢驗研究所，安徽 黃山 245041）

甲硝唑，化學式為C6H9N3O3，是咪唑類抗阿米巴、抗滴蟲、抗厭氧菌藥，因其具有抗菌力廣、殺菌力強、毒副作用小、無耐藥性等優點，現已成為治療厭氧菌感染的基本藥物之一［1］.其傳統的劑型主要有片劑和注射劑，臨床應用主要用于治療牙周疾病、抗腹部術后感染、抗陰道滴蟲等.

甲硝唑含量測定的方法有很多，如紫外分光光度法［2］，反相高效液相色譜法［3-4］，差分脈沖溶出伏安法［5］，氣相色譜-質譜聯用法［6］，流動注射化學發光法［7］、反相流動注射化學發光法［8］，荷移增敏分光光度法［9］等.除以上幾種方法外，姜爽等人曾采用pH滴定法［10］進行測定，但該方法有嚴格的濃度上的限制，不宜采用；朱梅芳采用的是雙波長分光光度法［11］，此方法利用多種波長測定，操作較為繁瑣，不便于快速測定.

《中國藥典》2000年版中對甲硝唑的含量測定使用容量法［12］.反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分離效率高，靈敏度高，速度快，且配以數據處理系統，大大提高了其結果的準確性，能夠將甲硝唑中的其它成分有效分離，并測出單一組分甲硝唑的含量［13］.而紫外-可見分光光度法（UV）測定甲硝唑的操作條件要求不高，并且具有簡便、快速及準確的優點，因此也被廣泛地應用［14］.為分析三種方法的優缺點，本文擬通過實驗建立RP-HPLC、UV及容量法三種方法測定甲硝唑含量的方法對比.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗儀器及藥品

甲醇為市售色譜純，鹽酸、冰乙酸、醋酐、高氯酸、α-萘酚苯甲醇均為市售分析純，實驗用水為超純水；甲硝唑片劑為湖北華中藥業有限公司生產；甲硝唑對照品為分析純，中國藥品生物制品檢定所生產.

Sartorius BS110S電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；UV-2550紫外分光光度計（SHIMADZU公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 容量法

參照2005版藥典二部的相關內容.取甲硝唑20片，精密稱定，細磨.根據藥典上關于甲硝唑約0.13 g的量的規定，精密稱取適量細粉，然后緩慢加入冰乙酸10 mL，攪拌使之完全溶解.再滴加1%的萘酚苯甲醇指示液約2滴，用高氯酸滴定液（0.1 mol/L）滴定，直至溶液呈淺綠色為止.實驗結果的校正可利用空白試驗.用1 mL高氯酸滴定液相當于消耗17.12 mg C6H9N3O3的量的比例來計算藥片所含有甲硝唑的量.

1.2.2 紫外分光光度法

參照2005版藥典二部的相關內容.取本品10片，精密稱定，細磨.根據藥典上關于甲硝唑約50 mg的量的規定，精密稱取適量細粉.然后用漏斗將藥粉導入100 mL量瓶中，再加入HCl溶液（0.1 mol/L）80 mL，水浴微溫使之完全溶解.待其溫度恢復到室溫后，用HCl溶液（0.1 mol/L）稀釋至刻度.搖勻后濾過，濾液精密量取5 mL，置于200 mL量瓶中.再用HCl溶液（0.1 mol/L）稀釋量取的濾液至刻度，搖勻后測定其在277 nm的波長處的吸光度值.結果根據藥典上關于甲硝唑藥片吸收系數的規定，按照吸收系數為377計算即可.

UV-2550的測量方式為吸收值；狹縫寬為0.2 nm；光源轉換波長為350.0 nm；室溫為17℃；相對濕度為60%.波長范圍（nm）為290.0到260.0；掃描速度為中速；采用間隔為0.2 s；自動采樣間隔為停用；掃描模式為自動.

空白溶劑的適用條件按照標準規定，波長在251 nm到300 nm處的吸光度值不得超過0.10.本實驗測得空白溶劑在277 nm波長處的吸光度值為0.049，符合標準.

1.3 高效液相色譜法

溶液制備參照2005版藥典二部的相關內容，對照品需要在105℃下干燥至少2 h以上才能使用.用分析天平稱取0.124 5 g甲硝唑對照品，置于50 mL容量瓶中，加適量50%甲醇（約30 mL）振搖使其溶解，當其完全溶解后用流動相定容至刻度，制成的溶液中含2.49 mg/mL的甲硝唑.供試品溶液是根據藥典上關于甲硝唑約100 mg的量的規定，精密稱取適量細粉，然后用漏斗輕輕導入到50 mL容量瓶中，加適量50%甲醇（約30 mL）振搖使其溶解后用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的濾膜濾過.

分別量取對照品溶液和供試品溶液各20 μL注入高效液相色譜儀中，并且記錄色譜圖和相關數據.本實驗方法采用的是外標法，故以峰面積計算.

高效液相色譜儀器參數與適用性條件如下：色譜柱：Gemini C18 125×4.6 mm，5 μm，填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相：甲醇-水（20∶80），流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：320 nm，進樣量：20 μL.

2 結果與討論

2.1 實驗結果

容量法：兩次樣品取樣量分別為0.171 9 g，0.172 1 g，消耗體積分別為7.45 mL，7.33 mL，空白消耗體積為0.05 mL.用1 mL高氯酸滴定液相當于消耗17.12 mg C6H9N3O3的量的比例來計算藥片所含有甲硝唑的量，可得標示含量分別為93.19%，91.57%，平均值為92.38%，相對偏差為1.75%.其中標示含量按照下式計算，即：

式中，V樣品=V總-V空白，即扣除空白后樣品實際消耗的滴定液體積.

UV法：兩次取樣量分別為0.066 28 g，0.065 78 g，測得樣品在277 nm波長處的吸收值分別為0.513、0.512.空白溶劑在277 nm波長處的吸光度值為0.049.計算可得標示含量分別為98.20%，98.74%，平均值為98.47%，相對偏差0.55%.其中標示含量按照下式計算.

式中，A樣品=A總-A空白，即扣除空白后樣品的實際吸光度值；E為吸光度系數，甲硝唑的吸收系數為377.

RP-HPLC 法：對照品峰面積（n=5）分別為 7 579.6，7 601.7，7 590.6，7 589.3，7 583.8，平均峰面積 7 592.2，RSD值（應不大于2.0%）為0.09%，響應因子（f）為3 049.1.兩次取樣品分別為0.165 2 g，0.165 2 g，供試品峰面積（n=2）分別為：7 411.4，7 413.2.計算可得標示含量分別為97.26%，97.28%，平均值為97.27%，相對偏差0.02%.其中標示含量按下式計算.

式中，A為峰面積，f為響應因子.

三種實驗方法的結果比較見表1.

表1 RP-HPLC、UV及容量法測定甲硝唑的含量對照

2.2 結果分析與討論

參照《中華人民共和國藥典》二部2005版有關標準的規定，所測甲硝唑的含量，應為標示量的93.0%到107.0%.從表1可以看出，本實驗中容量法、UV法、HPLC法所測定的甲硝唑的平均標示含量分別為92.38%、98.47%、97.27%.相對偏差分別為1.75%、0.55%、0.02%.其中，容量法所測定結果已超出標示量范圍，且相對偏差明顯偏大.在容量法中，使用萘酚苯甲醇作為指示劑，該指示劑在堿性范圍為藍綠色，酸性范圍為黃至綠色，以溶液呈淺綠色為滴定終點，由于酸堿型體的顏色對比度不高，在實際操作過程中，對于滴定終點的判斷存在一定困難，容易造成較大誤差.但該法樣品處理過程無需過濾即可直接滴定，因此方便用作實驗室的常規分析，但不適合作為質量控制的手段.

UV法和HPLC法測定甲硝唑片劑中甲硝唑的含量，均在藥典標示量范圍內，且相對偏差較小，準確度高，精密度好.其中，UV法需要扣除試劑空白，而HPLC法由于具有分離系統色譜柱的存在，無需扣除試劑空白，專屬性更強，選擇性更高，干擾更小.綜合考慮儀器的普及率以及實驗的成本，UV法適合成分較簡單的原料藥的分析，而HPLC法更適合復雜樣品的分析.

3 結語

甲硝唑有多種分析方法，各有優點與不足.章竹君采用的流動注射化學發光法［7］、李宇等人采用的反相流動注射化學發光法［8］、李芳等人的荷移增敏分光光度法［9］、姜爽采用的pH滴定法［10］以及朱梅芳采用的雙波長分光光度法［11］等方法測定甲硝唑片中甲硝唑的含量都實際可行.但較之高效液相色譜法和紫外分光光度法，均不夠簡便、快速和準確，操作也較為繁瑣.本實驗結果表明：采用高效液相色譜法和紫外分光光度法測定甲硝唑的含量均方便、快速并且準確.但較之紫外分光光度法而言，高效液相色譜法的專屬性更強，靈敏度更高，結果也更可靠和準確，適合成分復雜制劑的質量控制，所以高效液相色譜法更適用于甲硝唑藥品含量測定的精密檢測.故建議采用HPLC法測定甲硝唑片的含量.

為了更好的提高檢驗質量，還應該進一步研究探索，特別是在提取、分離方法上，以期發現更加合理的檢測方法.

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·臨床用藥須知［M］.北京:化學工業出版社，2005:769-770.

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