骨友靈巴布膏微生物限度檢查方法的建立

王瑛 楊錚 楊利紅

骨友靈巴布膏微生物限度檢查方法的建立

王瑛 楊錚 楊利紅

目的建立骨友靈巴布膏的微生物限度檢查方法。方法細菌計數采用培養基稀釋法、霉菌及酵母菌計數采用平皿法，控制菌檢查采用常規法與培養基稀釋法。結果細菌、霉菌及酵母菌的菌回收率均大于70%，控制菌檢查中，各陽性試驗菌均檢出，陰性對照無菌生長。結論本法可消除骨友靈巴布膏的抑菌作用，適用于該制劑的微生物限度檢查。

骨友靈巴布膏;微生物限度檢查;方法學驗證

骨友靈巴布膏具有活血化瘀、消腫止痛的功效，用于骨質增生引起的功能性障礙、軟組織損傷及大骨節病所引起的腫脹疼痛。為了有效控制藥品的質量，保證微生物限度檢查方法的科學性和檢驗結果的準確性，根據《中國藥典》2010年版[1]附錄微生物限度檢查的新要求，對骨友靈巴布膏進行了微生物限度檢查的方法學驗證。

1 材料

1.1試藥與培養基 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、溴化十六烷三甲基三甲銨瓊脂培養基。以上均為北京三藥生產。

1.2試驗用菌 白色念珠菌[CMCC(F)98 001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98 003]，銅綠假單胞菌[CMCC(B)10 104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63 501]、大腸埃希氏菌[CMCC(B)44 102]

1.3樣品 骨友靈巴布膏(哈藥集團人民同泰制藥廠，批號：091101，規格：7 cm×10 cm/片)

2 方法與結果

2.1菌液制備 接種白色念珠菌的新鮮斜面培養物至改良馬丁培液體養基中，在23℃～28℃培養24 h，取上述培養液用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍依次稀釋至濃度約為50～100 cfu/ml備用；取黑曲霉菌新鮮斜面培養物，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液[2]適量將孢子洗下，并用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至濃度約為50～100 cfu/ml，備用。

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮斜面培養物于胰酪胨大豆肉湯培養基中，在30℃～35℃培養18～24 h；分別取上述培養液用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍依次稀釋至濃度約為50～100 cfu/ml-1備用。

2.2供試液制備 取樣品100 cm2，去掉橡膠膏劑的保護層，放置在無菌玻璃板上，粘貼面朝上，用無菌紗布覆蓋橡膠膏劑的粘貼面上。然后將其置于含10 ml無菌聚山梨酯-80和90 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的三角瓶中，用力振蕩30 min，制成1 ∶10供試液。

2.3細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證 ①試驗組:取1 ∶10供試液1 ml，分別加入5個平皿中(每皿0.2 ml)，加入各細菌試驗菌1 ml,再加入營養瓊脂培養基,按規定條件培養；霉菌及酵母菌計數采用平皿法：取 1 ∶10供試液1 ml，加入各霉菌及酵母菌試驗菌1 ml,再加入玫瑰紅鈉瓊脂培養基，置規定條件培養。(n=3)。②菌液組取稀釋好各菌液1 ml，方法同試驗組,測定所加試驗菌數(n=3)。③供試品對照組測定樣品本底的菌數，方法同試驗組，不加陽性對照菌(n=3)。④稀釋劑對照組取試驗用稀釋劑代替供試液測定，方法同試驗組(n=3)。⑤回收率結果試驗組菌回收率%=(試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數×100%。稀釋劑對照組菌回收率%=稀釋劑對照組平均菌落數/菌液組平均菌落數×100%。平均回收率結果見表1。

表1 細菌、霉菌及酵母菌方法驗證的平均回收率(%)

從表1可以看出，5株試驗菌的試驗組菌回收率與稀釋劑對照組的菌回收率均大于70%，因此，可采用該方法測定樣品 骨友靈巴布膏細菌、霉菌及酵母菌數。

2.4控制菌檢查方法的驗證

2.4.1試驗組 取1 ∶10供試液10 ml(2份)，分別接種至100 ml膽鹽乳糖培養基和200 ml營養肉湯培養基中，再分別加陽性對照菌金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌液各1 ml，搖勻，置30℃～35℃培養18～24 h。

2.4.2陰性對照組 取等量稀釋劑，方法同試驗組(不加陽性對照菌液)。

2.4.3驗證結果試驗組 檢出陽性試驗菌，陰性對照組無菌生長，見表2。

表2 控制菌檢查方法學驗證結果

從表2看出，該控制菌檢查方法適用于本品的檢查。

3 討論

骨友靈巴布膏為外用貼膏劑，屬于中藥品種，《中國藥典》2010年版以前未收載此劑型。因此，在實際操作中各單位采用的樣品前處理方式不同，易造成樣品溶解程度不一致，因而可能導致驗證試驗結果不可靠。筆者在進行本試驗的過程中，供試品溶液的制備采用將樣品貼于無菌紗布等材料上，以含表面活性劑的無菌溶劑進行浸泡，該法使樣品的有效成分能夠完全充分溶散，令驗證方法更加準確。

骨友靈巴布膏具有抑菌作用，因此，細菌計數不能采用常規平皿法進行試驗，本試驗采用培養基稀釋法進行測定，能夠有效去除樣品自身的抑菌作用。

[1] 中國藥典.一部. 2010:79-88.

[2] 李云龍.中國藥品檢驗標準操作規范.北京: 中國醫藥科技出版社, 2010:363.

150001 哈爾濱，黑龍江省食品藥品檢驗檢測所

王瑛