缺氧誘導因子1α在人慢性牙周炎牙齦組織中的表達*

施慶顏, 靳 華, 藍 田, 李 娟, 黃世光△

(1暨南大學醫學院口腔醫學系, 廣東 廣州 510632； 2武警廣東省總隊醫院口腔科，廣東 廣州 510507)

缺氧誘導因子1α在人慢性牙周炎牙齦組織中的表達*

施慶顏1, 靳 華2, 藍 田1, 李 娟1, 黃世光1△

(1暨南大學醫學院口腔醫學系, 廣東 廣州 510632；2武警廣東省總隊醫院口腔科，廣東 廣州 510507)

目的觀察人慢性牙周炎牙齦組織中缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的表達水平，探討HIF-1α在牙周炎發病中的可能作用。方法將55例自愿接受研究的牙周炎患者按照牙周炎的病變程度分成3組：正常對照組15例、中度牙周炎組20例和重度牙周炎組20例。取牙齦組織標本，4%中性甲醛液固定48 h以上。制作牙齦組織的連續切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察各組牙齦組織的組織學改變；免疫組織化學染色法觀察各組牙齦組織HIF-1α的表達水平。結果(1) 與正常對照組相比，各慢性牙周炎組的牙齦組織HIF-1α的表達水平顯著升高(P<0.01)；(2) 重度牙周炎組HIF-1α陽性細胞比例明顯高于中度牙周炎組(P<0.05)；(3) HIF-1α 陽性細胞比例與牙周炎的病變程度呈正相關。結論人慢性牙周炎牙齦組織中HIF-1α 的表達水平隨著牙周炎病變程度的加重而升高，提示組織缺氧可能在牙周炎的疾病進程中起著重要的作用。

牙周炎； 缺氧誘導因子1α； 缺氧

牙周炎是由菌斑微生物作為始動因子引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病[1]。缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)是組織細胞在缺氧狀態下由激活基因所編碼的轉錄因子。越來越多的研究表明HIF-1α在感染和免疫方面發揮重要作用[2]。牙周炎發生時，組織炎癥腫脹導致局部組織缺血、缺氧誘導HIF-1α的表達，HIF-1α可在IL-1β等炎癥因子的激活下增強破骨細胞活性或協同其它細胞因子間接加速破骨細胞活動。我們前期的研究顯示，心理應激刺激通過增加牙周組織HIF-1α的表達降低牙周組織氧代謝水平，從而加重大鼠牙周炎癥程度[3-4]。然而，目前關于HIF-1α在人慢性牙周炎中的表達情況尚無文獻報道。本研究通過檢測HIF-1α 蛋白在人慢性牙周炎牙齦組織的表達情況來判斷組織的氧代謝情況，探討慢性牙周炎的炎癥程度與HIF-1α 表達的關系。

材 料 和 方 法

1研究對象

1.1牙周炎病例選擇 選擇2011年～2012年在暨南大學荔灣口腔教學醫院牙周科門診就診的自愿接受本研究的牙周炎患者，年齡為20～65歲，其中男性37名(43歲±12歲)，女性28名(45歲±12歲)，各實驗組在年齡、性別上差異無統計學意義。受試者均無糖尿病和其它系統性疾病；6個月內無服用抗生素藥物；無食物、藥物過敏史；非孕婦或服用避孕藥的婦女；1年內沒有進行牙周手術治療。納入標準依據美國牙周病學會1999年的牙周病新分類指南[5]；所有受試者均簽署知情同意書。

1.2分組 (1)正常對照組：取自因正畸治療需要拔除的正常前磨牙且牙周健康者，無牙周袋，無附著喪失，X線片顯示無牙槽骨吸收，牙齦無炎癥，共15 例；(2)中度牙周炎組: 牙齦有炎癥，探診出血，牙周袋4～6 mm，附著喪失3～4 mm，牙槽骨吸收在根長1/3～2/3以內，共20例，為慢性牙周炎接受牙周翻瓣術者；(3)重度慢性牙周炎組: 牙周袋>6 mm，附著喪失≥5 mm，牙齒松動Ⅲ度，牙槽骨吸收超過根長2/3以上，共20例，為無保留價值或預后極差的牙周炎患牙需要拔除者。

2方法

2.1組織標本采集、處理與觀察 牙齦標本于4%中性甲醛液中固定48 h以上，制成5 μm厚度牙齦組織連續切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察牙齦的組織學改變。由2名病理醫師盲法觀察，并對牙齦組織的炎性細胞浸潤情況進行評分，求其平均值。炎癥程度評分標準參照Huang等[4]的方法：0分,無炎癥細胞浸潤；1分,輕度炎癥，炎癥細胞局部呈小灶狀浸潤；2分,中度炎癥，炎癥細胞呈灶狀及片狀浸潤；3分,重度炎癥，炎癥細胞在牙齦組織內呈彌漫性浸潤。

2.2HIF-1α免疫組織化學染色及評分標準 采用免疫組織化學SP法對牙齦組織進行染色，I抗HIF-1α(Millipore)，稀釋濃度為1∶150，DAB顯色液顯色。陰性對照采用PBS緩沖液代替I抗，蘇木素復染。免疫組化陽性信號為棕黃色細小顆粒，定位于細胞核或細胞漿。每個切片計數5個200倍視野下總細胞數及陽性細胞數，計算陽性細胞比例。由2名病理醫師于光鏡下觀察細胞形態并計數，取其平均值，為該標本的陽性細胞比例。免疫組化染色評分標準參照Huang等[4]的方法：0，無染色；+，陽性細胞比例<1%；++，陽性細胞比例為1%～10%；+++，陽性細胞比例為10%～40%；++++，陽性細胞比例為40%～70%；+++++,陽性細胞比例為>70%。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 13.0 統計學軟件進行分析處理。不同組間牙齦組織炎癥程度評分和HIF-1α免疫組化染色陽性細胞比例的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析。牙周炎炎癥程度和HIF-1α免疫組化染色得分之間的相關性采用Pearson相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1組織學改變

牙齦組織的組織學改變見圖1。正常對照組幾乎沒有炎癥細胞浸潤(圖1A)；中度牙周炎組見少量散在慢性炎癥細胞浸潤(圖1B)；重度牙周炎組可見大量慢性炎癥細胞浸潤，出現大范圍的淋巴細胞、漿細胞和單核細胞浸潤，并可見散在分布的多形核細胞和巨噬細胞(圖1C)。

Figure 1. Representative photomicrographs of human gingival tissues (HE staining,×200). A：no inflammatory infiltration in clinically healthy gingival tissues; B：moderation inflammatory infiltration in moderate chronic periodontitis group; C：intense inflammatory infiltration in severe chronic periodontitis group.

圖1各組牙齦組織觀察

2HIF-1α免疫組織化學染色結果

HIF-1α免疫組化染色結果見圖2。正常對照組牙齦組織中見少量弱陽性細胞(圖2A)；中度慢性牙周炎組牙齦組織見較多的HIF-1α陽性細胞(圖2B)，重度牙周炎組(圖2C)HIF-1α陽性表達明顯高于中度牙周炎組。各組陽性細胞比例見圖3。與正常對照組(6.21%±0.86%)相比，慢性牙周炎牙齦組織HIF-1α 的陽性表達顯著升高(P<0.01)；重度牙周炎組牙齦組織HIF-1α 的陽性表達(83.47%±3.09%)明顯高于中度牙周炎組(68.57%±2.06%，P<0.05)。

Figure 2. Immunohistochemical staining for HIF-1α protein in human gingival tissues(×400). Positively stained cells can be visualized by the brown nuclei. In clinically healthy group (A), positive nuclear staining was observed <10%of cells or with distinct cytoplasm. In moderate chronic periodontitis group (B), positive nuclear staining was observed in 40% to 70% of cells.In severe chronic periodontitis group (C),positive nuclear staining was observed in >70% of cells or with strong cytoplasmic staining.

圖2各組牙齦組織中HIF-1α的表達

Figure 3. Scores of inflammation and HIF-1α expression in gingival tissues.A: healthy control (n=15); B: moderate chronic periodontitis group (n=20); C: severe chronic periodontitis group (n=20).Mean±SD.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB.

圖3各組牙周炎炎癥程度和HIF-1α免疫組化染色評分比較

3牙周炎炎癥程度與HIF-1α表達的相關性分析

圖3表明隨著牙周炎的病變程度增加，牙齦組織的炎癥程度加重；重度牙周炎組的炎癥評分顯著高于中度牙周炎組(P<0.01)；同時，隨著牙周炎的病變程度增加，HIF-1α免疫組化的得分也隨之增加。經Pearson相關分析，牙周炎炎癥程度與牙齦組織HIF-1α的表達水平密切相關，且呈正相關關系(r=0.864,P<0.05)。

討 論

牙周炎是導致成人牙齒喪失的最主要病因，其致病機制尚未清楚。牙周炎時，牙齦組織腫脹導致牙周微環境處于缺氧狀況，各種促炎細胞因子升高。組織在缺氧狀態下，細胞內缺氧反應基因轉錄和表達發生改變，從而對缺氧做出應激反應，組織出現一系列適應性變化。缺氧反應基因的調控主要通過HIF-1α來實現。以往對HIF-1α的研究主要集中于血管生成、腫瘤等方面，最近的研究表明HIF-1α在炎癥過程中也發揮著重要作用[6-7]，HIF-1α在人慢性牙周炎的表達尚未見報道。HIF-1α是低氧應答時誘導基因表達和恢復細胞內環境穩定的一個核心調節因子。在缺氧條件下，細胞產生HIF-1α與靶基因中的HRE結合點結合，促進其轉錄，引起一系列細胞對泛氧的反應，以保持機體的氧穩態[8-9]。

HIF-1α作為缺氧條件下細胞應答的調控因子，許多研究表明其與腫瘤的發生、預后及治療反應存在密切關系。研究發現，在胰腺癌、結腸癌、肺癌和乳腺癌中HIF-1α與增殖細胞核抗原呈正相關[10]。研究表明缺氧明顯影響組織細胞對細胞因子的表達，如IL-1β、前列腺素E2和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等[11]。研究證實TNF-α是破骨細胞分化的協同刺激因子，TNF-α能通過刺激破骨細胞的分化和成熟，或作用于骨基質，使破骨細胞暴露并與其相互作用[12-13]。HIF-1α通過其靶基因如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉化生長因β等間接調節破骨細胞的形成和活化[14-16]。在缺氧狀態下，由于機體血液黏滯度增高，微循環血流減慢，造成血管管腔狹窄，甚至形成血栓，導致牙周組織供氧不足，從而有利于牙周致病菌的生長，降低了牙周組織的防御和修復能力，同時，無氧代謝增強，有害物質也隨之增加[17-18]。Motohira等[19]研究表明，缺氧條件下刺激牙周膜細胞產生VEGF，VEGF可分別通過細胞外信號調節激酶1/2依賴機制和VEGF-Flt-1-FAK途徑介導破骨細胞前體細胞的趨化性和破骨細胞的形成，導致牙槽骨吸收。我們前期的研究證明心理應激增加HIF-1α在牙周炎組織中的表達，其表達程度與牙周炎的病變程度密切相關[4]，提示心理應激可能通過降低牙周組織局部的氧代謝水平，使局部組織處于缺氧狀態，促使HIF-1α的表達升高，參與牙周病的炎癥進程。

我們的結果顯示,HIF-1α在慢性牙周炎牙齦組織中的表達顯著高于正常牙齦組織，其表達強度隨著牙周炎病變程度的加重而明顯增強。這提示牙周炎存在明顯的缺氧狀況，缺氧引起的基因表達改變可能是牙周炎發病和疾病進程中的一個關鍵環節。此外，HIF-1α也是重要的炎癥和免疫反應因子[20-21]，其表達增強除了表明組織氧代謝降低外，還可能參與炎癥進程的調節，與炎癥發展有著多方面的聯系。組織缺氧加重HIF-1α 的大量產生，一方面直接損傷牙周組織，影響牙周組織的代謝和修復，另一方面上調了炎癥的NF-κB信號通路，炎癥介質在牙周組織中過表達，介導組織的免疫損傷，產生級聯放大效應，進一步加重了牙周組織破壞和微血管循環障礙，從而加速了牙周炎病變的進程[22-23]。

綜上所述，HIF-1α表達增強表明牙周組織氧代謝降低，同時HIF-1α表達強度與牙周炎的病變程度密切相關，提示其可能參與牙周炎的病變進程。本研究結果對闡明牙周炎的發病機制及為牙周炎輔助治療提供了理論依據。

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Expressionofhypoxia-induciblefactor1αinhumangingivaltissueswithchronicperiodontitis

SHI Qing-yan1, JIN Hua2, LAN Tian1, LI Juan1, HUANG Shi-guang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofStomatology,ArmedPoliceHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou510507,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To observe the expression of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) in human gingival tissues with chronic periodontitis.METHODSA total of 55 volunteers, including 15 healthy controls, 20 cases of moderate chronic periodontitis and 20 cases of severe chronic periodontitis, were involved in this study, and their gingival specimens were taken and fixed in 4% neutral formalin. The histological changes of gingival tissues were observed by HE staining, and the expression of HIF-1α in gingival tissues was detected by immunohistochemical staining.RESULTSThe proportion of HIF-1α positive cells in gingival tissues was significantly higher in chronic periodontitis groups than that in healthy control group (P<0.01), and that in severe chronic periodontitis group was significantly higher than that in moderate chronic periodontitis group (P<0.05). There was a significantly positive correlation between the severity of chronic periodontitis and the proportion of HIF-1α positive cells in gingival tissues.CONCLUSIONThe expression of HIF-1α in human gingival tissues is increased with the severity of chronic periodontitis, suggesting that hypoxia may play an important role in chronic periodontitis.

Periodontitis; Hypoxia-inducible factor 1α; Hypoxia

R781

A

1000- 4718(2013)09- 1668- 04

2013- 03- 30

2013- 07- 02

廣東省醫學科研基金資助項目(No.A2013454)

△通訊作者 Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.023