Nrf2-ARE通路在缺氧/吡那地爾后處理減輕大鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用*

喻守佳, 王海英, 喻 田, 劉興奎

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563003)

Nrf2-ARE通路在缺氧/吡那地爾后處理減輕大鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用*

喻守佳, 王海英△, 喻 田, 劉興奎

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563003)

目的探討核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路在缺氧后處理和吡那地爾后處理減輕大鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用。方法建立成年大鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧模型，分離、培養(yǎng)心肌細胞，隨機分為6組(n=8)：正常組(N組)、模型組(M組)、缺氧后處理組(IPO組)和不同濃度吡那地爾后處理組(P25組、P50組和P100組)。分離后的心肌細胞培養(yǎng)20 h后，除N組繼續(xù)培養(yǎng)外，其余各組均缺氧45 min，復(fù)氧60 min。IPO組缺氧45 min后復(fù)氧、缺氧循環(huán)3次，每次各5 min，在繼續(xù)復(fù)氧60 min；P25組、P50組和P100組缺氧45 min后分別以25、50和100 μmol/L吡那地爾處理5 min，復(fù)氧60 min。采用real-time PCR及Western blotting技術(shù)檢測復(fù)氧末心肌細胞中Nrf2、血紅素加氧酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)和超氧化物歧化酶1(SOD1) mRNA及蛋白表達水平。結(jié)果與N組比較，其它各組與Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1的mRNA及蛋白質(zhì)表達均降低(P<0.05)；與M組比較，其它各組mRNA及蛋白質(zhì)表達均顯著增高(P<0.05)；其中IPO組和P50組mRNA轉(zhuǎn)錄量顯著高于P25組和P100組(P<0.05)；P25組SOD1 mRNA顯著高于P100組(P<0.05)。IPO組和P50組Nrf2、SOD1和NQO1蛋白質(zhì)表達顯著高于P25和P100組(P<0.05)；P50組HO-1蛋白質(zhì)表達量顯著高于IPO組、P25組和P100組(P<0.05)；P25組HO-1和NQO1蛋白質(zhì)表達顯著高于P100組(P<0.05)。結(jié)論缺氧后處理和吡那地爾后處理可能通過激活Nrf2-ARE通路減輕大鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷。

核因子E2相關(guān)因子2； 吡那地爾； 缺氧復(fù)氧損傷； 心肌細胞； 后處理

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)通路可通過誘導(dǎo)心肌細胞表達一系列抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶，發(fā)揮心肌保護效應(yīng)[1]。研究證實，缺氧后處理和吡那地爾(pinacidil，P)后處理心肌保護作用明確[2-3]，但具體機制仍不十分清楚，Nrf2-ARE通路是否參與了缺氧后處理和吡那地爾后處理的心肌保護作用機制尚有待探討。本研究擬評價Nrf2-ARE通路在缺氧后處理和吡那地爾后處理減輕大鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物選擇和分組 健康雄性清潔級SD大鼠，體重250～300 g，4～5月齡(由第三軍醫(yī)大學(xué)試驗動物中心提供，動物證書號為SCXK(渝)2007-0005。將分離培養(yǎng)過夜后的心肌細胞隨機分為6組(n=8)：正常組(N組)、模型組(M組)、缺氧后處理組(IPO組)和不同濃度的吡那地爾后處理組(P25組、P50組和P100組)。

1.2主要試劑 吡那地爾、M199培養(yǎng)基、層黏連蛋白(laminin)、HEPES、肌酸(creatine)、牛磺酸(taurine)、牛血清白蛋白、EGTA、粗制Ⅱ型膠原酶等以上試劑均購自Sigma。BCA蛋白濃度測定試劑盒由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒均購自大連TaKaRa生物工程公司。所用引物由大連TaKaRa生物工程公司根據(jù)設(shè)計合成，見表1。

1.3主要儀器 2400PCR擴增儀(PE)、實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad),Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)(基因有限公司)和Mini Trans-Bloe電泳儀(Bio-Rad)。

2方法

2.1分離培養(yǎng)成年大鼠心肌細胞 腹腔注射異戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)和肝素(250 U·kg-1)后迅速沿劍突下打開胸腔，于主動脈根部剪下心臟，放入37 ℃ 750 μmol/L Ca2+液中。迅速將主動脈固定于Langendorff灌注管口，分別灌注氧合的750 μmol/L Ca2+液2 min、100 μmol/L無Ca2+EGTA液4 min、0.1% Ⅱ型膠原酶液15～20 min后剪開心肌，加入含有1% BSA的循環(huán)Ⅱ型膠原酶液，在氧合情況下振蕩消化5 min，37 ℃水浴中自然沉降，收集沉淀。向沉淀中加入新鮮的酶洗脫液洗滌3次，加入細胞培養(yǎng)基M199洗滌2次。將細胞數(shù)以104/cm2的密度平鋪于層黏連蛋白于6孔板中，加入M199培養(yǎng)3 h后，去除未貼壁細胞，重新加入新鮮M199培養(yǎng)過夜。

表1 引物序列

2.2心肌細胞缺氧復(fù)氧模型的建立 各組心肌細胞均培養(yǎng)20 h，除N組繼續(xù)培養(yǎng)外，其余各組均缺氧45 min，復(fù)氧60 min。IPO組缺氧45 min后復(fù)氧、缺氧循環(huán)3次，每次各5 min，再繼續(xù)復(fù)氧60 min；P25組、P50組和P100組缺氧45 min后分別以25、50和100 μmol/L吡那地爾處理5 min，復(fù)氧60 min。

2.3透射電鏡下觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu) 各組貼壁的心肌細胞經(jīng)0.1%胰酶消化，2%戊二醛固定，修整包埋后制作超薄切片，通過透射電鏡觀察每組心肌細胞的超微結(jié)構(gòu)。

2.4Real-time PCR檢測心肌細胞Nrf2、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)mRNA表達 培養(yǎng)后的心肌細胞經(jīng)Trizol一步法提取總RNA，通過紫外分光光度計檢測總RNA的含量及純度后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為下一步PCR模版，PCR擴增所用的寡核苷酸引物序列(表1)均由大連寶生物工程公司合成。按照real-time PCR試劑盒說明書進行操作，4倍梯度稀釋模板cDNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確認各個基因的擴增效率，確定cDNA上樣濃度。根據(jù)反應(yīng)條件在每個循環(huán)延伸末端收集熒光信號，繪制擴增曲線。40個循環(huán)后設(shè)置反應(yīng)步驟，對55 ℃到95 ℃升溫過程，每個0.5 ℃采集熒光信號，繪制融解曲線，采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量，以檢測心肌細胞中Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1 mRNA表達水平。

2.5Westem blotting法檢測Nrf2、HO-1、NQO1和SOD1蛋白的表達 于培養(yǎng)后向各組心肌細胞中加入RIPA裂解液3～5 s， 4 ℃、14 000×g冷凍離心5 min。上清液經(jīng)碧云天公司的BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒定量后分裝成40 μg/10 μL，-20 ℃凍存。按照Bio-Rad公司的SDS-PAGE電泳使用說明行蛋白質(zhì)電泳，電泳結(jié)束后按照Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1的分子量切取凝膠，并進行轉(zhuǎn)膜和封膜。每個目標(biāo)蛋白分別封閉I抗，PBS洗膜后再封閉熒光II抗，Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)掃描PVDF膜，記錄各組蛋白條帶相應(yīng)的熒光強度值。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1缺氧/吡那地爾后處理對細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)N組細胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)基本正常；M組破壞程度最嚴(yán)重，電鏡下心肌細胞線粒體腫脹、空泡，嵴斷裂成絮狀，部分線粒體已溶解破裂，核膜溶解消失，細胞核溶解形狀不規(guī)則；而P25組和P100組破壞程度較M組輕，電鏡下可見部分線粒體腫脹，嵴模糊或斷裂成絮狀，核膜基本較完整，細胞核皺縮；IPO組和P50組超微結(jié)構(gòu)線粒體輕度腫脹，嵴平行或少數(shù)斷裂，核膜較完整，細胞核輕度皺縮，完整性明顯優(yōu)于M組、P25組和P100組，見圖1。

Figure 1. Changes of the myocardial cell ultrastructure observed under transmission electron microscope (×20 000).

圖1透射電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)

2缺氧/吡那地爾后處理對細胞Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1mRNA表達的影響

與N組比較，其它各組與Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1 mRNA表達均明顯降低(P<0.05)；與M組比較，其它各組mRNA表達均顯著增高(P<0.05)；IPO組和P50組mRNA轉(zhuǎn)錄量顯著高于P25和P100組(P<0.05)；P25組SOD1 mRNA顯著高于P100組(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠心肌細胞Nrf2、SOD1、HO-1及NQO1 mRNA表達量的變化

▼P<0.05vsgroup N；■P<0.05vsgroup M；★P<0.05vsgroup IPO；●P<0.05vsgroup P25；▲P<0.05vsgroup P50.

3缺氧/吡那地爾后處理對細胞Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1蛋白表達的影響

與N組比較，其它各組與Nrf2、NQO1、SOD1及HO-1蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；與M組比較，其它各組蛋白表達均顯著增高(P<0.05)；P50組HO-1蛋白表達量顯著高于IPO組、P25組和P100組(P<0.05)；P25組HO-1和NQO1蛋白表達顯著高于P100組(P<0.05)，見圖2、表3。

Figure 2. Expression of Nrf2,SOD1,HO-1 and NQO1 proteins in myocardial cells in each group detected by Western blotting.

圖2各組心肌細胞Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1及GAPDH蛋白表達的免疫印跡圖

表3 各組大鼠心肌細胞Nrf2、SOD1、HO-1及NQO1蛋白質(zhì)表達量的變化

▼P<0.05vsgroup N；■P<0.05vsgroup M；★P<0.05vsgroup IPO；●P<0.05vsgroup P25；▲P<0.05vsgroup P50.

討 論

本研究表明，缺氧后處理和不同濃度吡那地爾后處理均能減輕心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的破壞程度，從而起到保護缺氧心肌細胞的作用。結(jié)合既往的研究及本研究的預(yù)實驗結(jié)果，本研究選擇25、50和100 μmol/L吡那地爾。Nrf2及其下游NQO1、SOD1和HO-1表達上調(diào)是Nrf2-ARE通路被激活的標(biāo)志[4]，本研究檢測到缺氧后處理和吡那地爾后處理均導(dǎo)致了這些基因表達上調(diào)。證實缺氧后處理和吡那地爾后處理可能通過激活Nrf2-ARE通路減輕心肌缺氧復(fù)氧損傷。

本研究觀察到50 μmol/L吡那地爾處理組Nrf2、NQO1、HO-1和SOD1表達水平高于25 μmol/L組和100 μmol/L組，且最大限度地降低了細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的損傷，說明50 μmol/L吡那地爾處理組抗心肌氧化應(yīng)激強于25 μmol/L和100 μmol/L組，最大限度地保護了心肌細胞。其機制可能是50 μmol/L吡那地爾后處理激活Nrf2-ARE通路及其Ⅱ相解毒酶下游基因表達上調(diào)的作用最強。

研究發(fā)現(xiàn)，藥物預(yù)處理能激活Nrf2-ARE通路，其Ⅱ相解毒酶下游基因表達上調(diào)，從而起到抗氧化應(yīng)激作用，發(fā)揮心肌保護效應(yīng)，且線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP sensitive potassium channel，mitoKATPC)開放可能參與激活了Nrf2-ARE通路[5]。因此，本研究推測缺氧后處理及吡那地爾后處理，心肌細胞mitoKATPC開放，誘使Nrf2-ARE通路活化，以對抗缺氧再灌注期所致的氧化損傷。減少鈣超載，保護線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)，發(fā)揮心肌保護效應(yīng)。

綜上所述，缺氧后處理和吡那地爾后處理可通過激活Nrf2-ARE通路減輕心肌缺氧復(fù)氧損傷，吡那地爾后處理可替代缺氧后處理產(chǎn)生心肌保護作用。

[1] 林曉萍，李 雯，沈華浩.抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子-Nrf2的研究進展[J].中國病理生理雜志，2011,27(6):1234-1239.

[2] Dosenko VE, Nagibin VS, Tumanovska LV, et al. Protective effect of autophagy in anoxia-reoxygenation of isolated cardiomyocyte?[J]. Autophagy, 2006,2(4):305-306.

[3] Kopustinskiene DM, Liobikas J, Skemien K, et al. Direct effects of KATPchannel openers pinacidil and diazoxide on oxidative phosphorylation of mitochondriainsitu[J]. Cell Physiol Biochem,2010, 25(2-3): 181-186.

[4] Tonq KI, Katoh Y, Kusunoki H, et al. Keap1 recruits Neh2 through binding to ETGE and DLG motifs: characterization of the two-site molecular recognition model[J].Mol Cell Biol, 2006, 26(8): 2887-2900.

[5] Piao CS, Gao S, Lee GH, et al. Sulforaphane protects ischemic injury of hearts through antioxidant pathway and mitochondrial KATPchannels[J]. Pharmacol Res, 2010, 61(4): 342-348.

RoleofNrf2-AREsignalingpathwayinprotectiveeffectofhypoxiaorpinacidilpostconditioningagainsthypoxia-reoxygenationinjuryinadultratcardiomyocytes

YU Shou-jia, WANG Hai-ying, YU Tian, LIU Xing-kui

(DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:wanghaiting-8901@163.com)

AIM: To investigate whether nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2)-antioxidant response element (ARE) signaling pathway is involved in the protective effect of hypoxia or pinacidil postconditioning against hypoxia-reoxygenation injury in adult rat cardiomyocytes.METHODSCardiomyocytes were isolated from the left ventricle of male adult Sprague-Dawley rats (250～300 g) by Langendorff perfusion and collagenase II digestion. The cells were randomly divided into six groups (n=8 in each group). The cells in N group were cultured for 22 h without any treatment. The cells in the other five groups were cultured for 20 h and then underwent 45 min of hypoxia followed by 60 min of reoxygenation (M group), three 5-min cycles of reoxygenation/hypoxia plus 60 min of reoxygenation (IPO group), or treatment with pinacidil (25, 50 and 100 μmol/L) for 5 min plus 60 min of reoxygenation (P25, P50and P100groups, respectively). The expression of Nrf2, NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1), heme oxygenase 1 (HO-1) and superoxide dismutase 1 (SOD1) at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blotting, respectively.RESULTSThe mRNA and protein levels of Nrf2, HO-1, NQO1 and SOD1 in M, IPO, P25, P50and P100groups were significantly decreased compared with N group (P<0.05), and those in IPO, P25, P50and P100groups were obviously higher than those in M group (P<0.05). The mRNA levels of Nrf2, HO-1, NQO1 and SOD1 in IPO and P50groups were obviously higher than those in P25and P100groups (P<0.05). The mRNA expression of SOD1 in P25group was obviously higher than that in P100group (P<0.05). The protein levels of Nrf2, NQO1 and SOD1 in IPO and P50groups were obviously higher than those in P25and P100groups (P<0.05). The protein expression of HO-1 in P50group was obviously higher than that in IPO, P25and P100groups (P<0.05). The protein levels of HO-1 and NQO1 in P25group were obviously higher than those in P100group (P<0.05).CONCLUSIONHypoxia or pinacidil postconditioning may attenuate hypoxia-reoxygenation injury in adult rat cardiomyocytes via activation of Nrf2-ARE signaling pathway.

Nuclear factor E2-related factor 2; Pinacidil; Hypoxia-reoxygenation injury; Cardiomyocytes; Postconditioning

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1696- 05

2013- 03- 02

2013- 07- 17

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30960366)

△通訊作者Tel：0852-8609838；E-mail:wanghaiting-8901@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.028