銀杏達莫注射液抑制大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的機制研究*

王 靜, 姜玉新, 崔鳳娟, 閔志雪, 周萍萍, 王海華

(皖南醫學院生理教研室, 安徽 蕪湖 241002)

銀杏達莫注射液抑制大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的機制研究*

王 靜, 姜玉新, 崔鳳娟, 閔志雪, 周萍萍, 王海華△

(皖南醫學院生理教研室, 安徽 蕪湖 241002)

目的觀察銀杏達莫注射液預處理對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的影響，并探討其可能的作用機制。方法SD雄性大鼠40只隨機分成5組(n=8)：正常對照(NC)組、缺血/再灌注(I/R)組、缺血預處理(IPC+I/R)組、銀杏達莫注射液預處理(GD+I/R)組和銀杏達莫+氯化鑭預處理(GD+LaCl3+I/R)組。觀察各組相同時點(預灌30 min穩定點，缺血30 min，再灌5 min、30 min、60 min)的心功能指標,包括心率(HR)、左室收縮壓(LVSP)和室內壓變化速率(±dp/dtmax)，同時收集各時點冠脈流出液，檢測其中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性。實驗結束后檢測心肌線粒體Ca2+濃度和α-酮戊二酸脫氫酶(α-OGDH)含量。結果與I/R組比較，IPC+I/R組和GD+I/R組在心臟再灌注期各項心功能指標均得到改善(P<0.05)；心肌LDH和CK的釋放量降低(P<0.01)；線粒體內Ca2+超載降低(P<0.01)，且線粒體內α-OGDH含量升高(P<0.05)；而GD+I/R組中銀杏達莫對心肌的保護作用被LaCl3抑制(P<0.05)。結論銀杏達莫可能通過抑制鈣超載、增強線粒體酶活性以穩定線粒體能量代謝，從而緩解缺血/再灌注誘導的心肌細胞損傷。

銀杏達莫注射液； 氯化鑭； 缺血/再灌注損傷； 鈣超載； 線粒體

缺血性心臟病(ischemic heart disease, IHD)是嚴重威脅人類健康的疾病，也是我國死亡率最高的疾病之一，而缺血后的再灌注又會對心肌產生嚴重的損傷，即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷，細胞內鈣超載是I/R損傷發生的最重要機制之一。細胞內Ca2+一直作為重要的第二信使發揮作用，但是鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)的發現使人們認識到，Ca2+可以作為第一信使與細胞膜上的CaSR結合，引起胞內鈣庫釋放Ca2+從而升高細胞內Ca2+濃度。大量研究證實CaSR參與了I/R損傷細胞內Ca2+超載，并且通過1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)通路引起肌漿網內鈣耗竭通過線粒體-肌漿網膜引起線粒體內鈣的變化從而誘發線粒體凋亡通路的活化[1-3]。銀杏達莫(ginkgo-dipyridamole, GD)是我國第4代銀杏葉提取物加入雙嘧達莫的復合制劑，因其具有保護血管內皮，調節機體代謝和末梢血液循環障礙等功效而廣泛應用于冠心病、血管栓塞、糖尿病等疾病的預防和治療；但目前尚未見到以GD作為預處理，研究其對I/R損傷心肌及線粒體的作用。本實驗采用Langendorff 離體心臟灌流技術，觀察銀杏達莫注射液對離體心臟缺血/再灌注損傷的影響，并探討其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1動物

SD雄性大鼠，體重(250±30)g，動物合格證號為SCXK(浙)20080033。

2主要試劑

乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase，α-OGDH)和Ca2+試劑盒購自南京建成生物工程研究所；氯化鑭(lanthanum chloride,LaCl3)購自Sigma; 銀杏達莫注射液為貴州益佰制藥公司生產，其余試劑均為國產分析純。

3主要設備

Langendorff離體心臟灌流裝置和Medlab/8C生物信號采集系統(南京美易科技有限公司)，紫外分光光度計(UV-3200PCS)，Model-680型酶標儀(Bio-Rad)。

4主要方法

4.1實驗分組 實驗動物共40只，隨機分5組(n=8)：(1)正常對照(normal control, NC)組，灌注全程均用富氧Krebs-Henseleit(K-H)液(118.4 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，1.1 mmol/L MgSO4，1.18 mmol/L KH2PO4，4.5 mmol/L NaHCO3，2.55 mmol/L CaCl2，11.1 mmol/L glucose，pH 7.4，充以95% O2和5% CO2的混合氣體)在恒溫(37 ℃)、恒壓(8.33 kPa)條件下灌注；(2)I/R組：富氧K-H液預灌30 min待心功能穩定，全心缺血缺氧30 min，隨后用富氧K-H液復灌60 min；(3)缺血預處理(ischemic preconditioning, IPC)+I/R組：富氧K-H液預灌30 min待心跳穩定，行全心缺血缺氧5 min，富氧K-H液再灌5 min，重復3次，隨后的方法同I/R組；(4)GD+I/R組：富氧K-H液預灌30 min待心功能穩定，用含銀杏達莫注射液(10 mg/L)的富氧K-H液預灌10 min，隨后的方法同I/R組；(5)GD+LaCl3+I/R組：富氧K-H液預灌30 min待心功能穩定，用含LaCl3(10 μmol/L)的K-H液預灌10min，隨后的方法同GD+I/R組。

4.2實驗方法 取健康大鼠，麻醉后迅速開胸取出心臟，置于0～4 ℃ K-H液中，主動脈插管懸掛于Langendorff離體心臟灌流裝置上以富氧(充以95%O2+5%CO2)K-H液逆行灌注，在恒溫(37 ℃)、恒壓(8.33 kPa)條件下，調整灌脈流量為6～8 mL·min-1·g-1心肌。在左心耳剪一小口，用自制的乳膠小球囊放入左心室內，通過Medlab生物信號采集處理系統記錄心功能指標，使左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)維持在0～10 mmHg，用富氧K-H液預灌至離體心臟心跳恢復和心功能指標穩定后開始實驗。記錄各組預灌30 min穩定點，缺血30 min，再灌5 min、30 min和60 min的心功能指標[左室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP)、心率(heart rate, HR)和左室內壓最大上升/下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure, ±dp/dtmax)]，同時收集各時點的冠脈灌流液，用比色法測定其LDH和CK活性，具體操作按試劑盒說明進行。

4.3線粒體勻漿制備 參照Spector等[4]的方法，實驗結束后，取心臟0.2 g，加9倍于心臟重量的預冷勻漿溶液進行勻漿；4 ℃、2 000 r/min離心10 min，取上清，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，沉淀物即為線粒體。將線粒體用20倍的預冷勻漿溶液制備成混懸液，用比色法測定Ca2+濃度，ELISA法檢測線粒體α-OGDH含量，具體操作按試劑盒說明進行。

5統計學處理

使用SPSS 16.0統計軟件處理。數據以均數±標準差(mean±SD)來表示，組間均數比較用單因素方差分析,以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1銀杏達莫對離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷心功能的作用

從表1組內結果看，I/R組在再灌5 min心功能恢復，但再灌30 min時心臟做功量(LVSP×HR)降低(與再灌5 min比較，P<0.05)，再灌60 min時做功量明顯降低(與再灌5 min比較，P<0.01)，說明出現了再灌注損傷。IPC+I/R組和GD+I/R組再灌30 min和60 min的做功量與再灌5 min相比均沒有出現明顯的降低；GD+LaCl3+I/R組再灌30 min做功量與再灌5 min相比沒有降低，但再灌60 min后做功量出現下降(與再灌5 min比較，P<0.05)。結果提示：I/R組再灌注過程中出現了心功能損傷；GD與IPC均緩解了缺血/再灌注心功能損傷，其機制可能與抑制細胞鈣超載，穩定線粒體能量代謝有關；加入LaCl3后，對心臟的保護作用有所降低。

表1顯示各組間心臟的做功量(LVSP×HR)在心臟穩定點均未見明顯差異；缺血30 min后，與NC組相比，I/R組、IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組心臟做功量均明顯降低(P<0.01)。與I/R組相比，再灌5 min時，IPC+I/R組和GD+I/R組做功量已開始恢復(P<0.05)，再灌30 min和60 min時均已明顯恢復(P<0.01)；但GD+LaCl3+I/R組做功量的恢復在再灌5 min時未見改善，而到再灌30 min至60 min時均出現改善(P<0.05)。加入10 μmol/L 的LaCl3后，GD+LaCl3+I/R組的做功量與GD+I/R組相比在再灌60 min差異顯著(P<0.05)。結果提示：GD與IPC類似，在再灌初期(5 min)即可使心肌損傷得到改善，加入LaCl3后，對心肌的保護效應被推遲，至再灌30 min才出現明顯結果，其機制可能與LaCl3增加了細胞內及線粒體內Ca2+濃度有關。

±dp/dtmax的結果顯示，I/R組再灌5 min時±dp/dtmax恢復，但再灌30 min時±dp/dtmax降低(與再灌5 min比較，P<0.05)，再灌60 min時±dp/dtmax明顯降低(與再灌5 min比較，P<0.01)，說明再灌注引起心肌細胞收縮能力的減弱。各組間在心臟穩定點無顯著差異(P>0.05)，缺血缺氧30 min后，與NC組相比，I/R組、IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組的+dp/dtmax均明顯下降(P<0.01)。與I/R組相比，再灌5 min和30 min后，IPC+I/R組和GD+I/R組的+dp/dtmax已開始恢復(P<0.05)，再灌至60 min時已明顯恢復(P<0.01)；但加入10 μmol/L LaCl3后，GD+LaCl3+I/R組的+dp/dtmax直至再灌60 min時才開始恢復(P<0.05)。而與GD+I/R組相比，GD+LaCl3+I/R組的+dp/dtmax在再灌30 min和60 min均差異明顯(P<0.05)。再灌過程中，各組心肌的-dp/dtmax的變化與+dp/dtmax的變化略有不同，如再灌5 min時，IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組的-dp/dtmax恢復程度與I/R組相比無明顯區別，而再灌30 min及60 min時出現差異(P<0.05)。結果提示：GD和 IPC能改善I/R過程心肌收縮能力及心肌順應性，加入LaCl3后，心肌收縮能力和順應性的恢復有所降低。

表1 銀杏達莫對離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷心功能的作用

*P<0.05，**P<0.01vsNC group at the same point；#P<0.05，##P<0.01vsI/R group at the same point；&P<0.05vsGD+I/R group at the same point；△P<0.05，△△P<0.01vsreperfusion 5 min in the same group.

2冠脈流出液中LDH和CK活性的變化

表2顯示，經過全心缺血缺氧30 min后，各組冠脈流出液中LDH和CK活性都隨時間推移逐漸升高，特別是I/R組再灌30 min與再灌5 min已出現顯著差異(P<0.05)，至再灌60 min已達顯著差異(P<0.01)。與NC組相比，缺血30 min時，I/R組、IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組LDH和CK活性均升高(P<0.05)。與I/R組相比，再灌5 min， IPC+I/R組、GD+I/R組和GD+LaCl3+I/R組的LDH和CK活性無顯著差異(P>0.05)；再灌30 min，IPC+I/R組和GD+I/R組的LDH和CK活性降低(P<0.05)，且再灌60 min時其活性明顯降低(P<0.01)；GD+LaCl3+I/R組的LDH和CK活性到再灌60 min出現差異(P<0.05)，見圖1。結果提示,再灌過程各組心肌均出現損傷，表現為細胞內酶(LDH和CK)的外漏，GD和IPC抑制了再灌注過程中心肌細胞內酶的外漏，但其效果在再灌初期并不明顯，到再灌30 min才出現明顯結果；加入LaCl3抑制酶外漏的效果減弱，到再灌60 min才出現明顯效果。

表2 冠脈流出液中LDH和CK活性的變化

*P<0.05，**P<0.01vsNC group at the same point；#P<0.05，##P<0.01vsI/R group at the same point.

3線粒體Ca2+濃度的組間變化

與NC組相比，I/R組心肌線粒體內明顯出現鈣超載(P<0.01)；與I/R組相比，IPC+I/R組和GD+I/R組鈣超載現象明顯得到緩解(P<0.01)，GD+LaCl3+I/R組鈣超載現象也得到緩解(P<0.05)；加入10 μmol/L LaCl3后，GD+LaCl3+I/R組的Ca2+濃度比GD+I/R組高(P<0.05),見圖1。結果提示：GD和IPC能抑制缺血/再灌注造成的線粒體鈣超載，其機制可能是抑制了細胞外Ca2+內流或者調節線粒體儲Ca2+能力；而且GD抑制鈣超載的作用在加入LaCl3后被減弱。

4線粒體α-OGDH含量的組間變化

NC組的α-OGDH含量處于較高水平，I/R組線粒體α-OGDH含量明顯降低(P<0.01)；與I/R組相比，IPC+I/R組和GD+I/R組α-OGDH含量明顯恢復(P<0.01)，GD+LaCl3+I/R組α-OGDH含量也有恢復(P<0.05)；加入10 μmol/L LaCl3后，GD+LaCl3+I/R組的α-OGDH含量比GD+I/R組有所降低(P<0.05)，見圖2。結果提示,GD和IPC能增加再灌注損傷后線粒體內能量代謝關鍵酶含量，其機制可能與穩定線粒體內Ca2+水平有關。

Figure 1. Changes of Ca2+concentration in mitochondria.Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsGD+I/R group.

圖1線粒體Ca2+濃度的變化

Figure 2. Changes of the content of α-OGDH in mitochondria.Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsI/R group;△P<0.05vsGD+I/R group.

圖2線粒體α-OGDH含量的變化

討 論

心肌I/R損傷在各類心臟手術(如心臟移植、心跳驟停復蘇及冠脈溶栓術等)中都有發生，但I/R損傷的病理生理機制尚未完全闡明。已有證據表明，再灌注啟動的最初數分鐘內即可出現細胞內鈣超載、線粒體能量合成障礙、氧自由基生成等現象[5]。通過缺血前的多次短暫的缺血-再灌措施即缺血預處理可通過降低細胞內鈣超載、改善內皮功能、減少中性粒細胞聚集等機理而有效地保護心肌[6-8]。CaSR屬于G蛋白偶聯受體C家族成員，主要功能是維持細胞內Ca2+和其它金屬離子的穩態。細胞外的Ca2+、其它多價陽離子(Gd3+、Mg2+、La3+等)、多胺、L-氨基酸等均可激活CaSR，CaSR激活后可以通過IP3通路引起肌漿網釋放Ca2+，引起細胞內Ca2+濃度升高，進而損傷線粒體并誘發細胞凋亡。CaSR在心肌I/R損傷中發揮關鍵作用，通過激活MAPKs-CytC-caspase-3通路和Fas受體死亡通路，誘導心肌細胞凋亡[9-11]。

心臟正常收縮和舒張功能對維持正常的血流動力有重要的意義。LVSP和+dp/dtmax可反映心肌最大收縮能力，-dp/dtmax反映心肌的最大舒張力，是衡量心肌舒張順應性的指標，HR從整體反映心臟的工作性能。心肌缺血/再灌注會導致心肌舒縮功能的降低，表現為持久的心輸出量減少以及±dp/dtmax降低等[12]。本研究發現銀杏達莫使再灌注期的LVSP和±dp/dtmax均明顯升高，說明銀杏達莫能使I/R損傷時心肌收縮能力增強，改善心肌順應性。缺血/再灌注損傷時，線粒體能量代謝障礙與鈣超載和氧自由基的產生互為因果，共同加劇了細胞的不可逆損傷，如細胞損傷和死亡、細胞內酶外漏(如LDH和CK)等[13-16]，而α-OGDH對線粒體的能量代謝和活性氧生成起著重要作用[17-18]。在I/R損傷時，由于細胞缺氧導致α-OGDH的含量降低[19]。本研究發現銀杏達莫可降低I/R損傷期間LDH和CK的外漏，同時提高了α-OGDH的含量，以緩解I/R所誘導的心肌損傷。銀杏達莫對I/R損傷心肌的保護作用可以被CaSR激動劑LaCl3抑制，因此我們推測銀杏達莫對I/R損傷心肌的保護可能與降低細胞內Ca2+濃度密切相關，通過調節Ca2+水平來穩定線粒體能量代謝從而延緩細胞凋亡。

綜上所述，本研究證實銀杏達莫可以通過抑制鈣超載、增強線粒體酶活性以穩定線粒體能量代謝，從而緩解缺血/再灌注對心肌細胞的損傷，而這種保護效應是否是銀杏達莫作為鈣通道阻斷劑而發揮作用，有待進一步研究。

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Inhibitoryeffectofginkgo-dipyridamoleinjectiononischemia/reperfusioninjuryinratheartsinvitro

WANG Jing, JIANG Yu-xin, CUI Feng-juan, MIN Zhi-xue, ZHOU Ping-ping, WANG Hai-hua

(DepartmentofPhysiology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail:wanghaihua9972@sina.com)

AIM: To investigate the effect of ginkgo-dipyridamole injection (GD) on ischemia/reperfusion (I/R) injury in rat heartsinvitroand its possible mechanism.METHODSForty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups (n=8): normal control (NC) group, I/R group, ischemic preconditioning (IPC)+I/R group, GD+I/R group and GD+LaCl3+I/R group. Cardiac function indexes, including heart rate (HR), left ventricular systolic pressure (LVSP) and the maximal rise/fall rate of left ventricular pressure (±dp/dtmax), were detected at 5 time points, including stabilizing point, 30 min after ischemia, and 5, 30 and 60 min after reperfusion. The activity of lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) in coronary effluent at the five time points was assayed. The concentration of Ca2+and the content of α-ketoglutarate dehydrogenase (α-OGDH) in myocardial mitochondria were determined at the end of the whole experiment.RESULTSCompared with I/R group, the cardiac function indexes in IPC+I/R and GD+I/R groups were improved at the reperfusion period (P<0.05), the activity of LDH and CK in coronary effluent and the concentration of Ca2+in mitochondria were significant reduced (P<0.01), and the content of α-OGDH was increased (P<0.05). However, the protective effect of GD was inhibited by LaCl3(P<0.05).CONCLUSIONGD protects rat hearts against I/R injury by inhibiting calcium overload and improving mitochondrial enzyme activity to stabilize mitochondrial energy metabolism.

Ginkgo-dipyridamole injection; Lanthanum chloride; Ischemia/reperfusion injury; Calcium overload; Mitochondria

中國病理生理學會2013年活動計劃表

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1573- 06

2013- 04- 15

2013- 06- 28

國家自然科學基金資助項目(No.81172790);安徽省自然科學研究重點基金資助項目(No.KJ2013A251);皖南醫學院中青年基金資助項目(No.WK201310);皖南醫學院重點科研基金資助項目(No.WK2012Z01)

△通訊作者 Tel： 0553-3866058; E-mail: wanghaihua9972@sina.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.006