過表達TAP1上調人膠質瘤細胞株U251 HLA-I的表達*

歐陽樂平， 張善義， 李軍亮， 許新科， 翁胤侖， 鄭眉光， 王圣文， 李方成

(中山大學孫逸仙紀念醫院神經外科，廣東 廣州 510120)

過表達TAP1上調人膠質瘤細胞株U251 HLA-I的表達*

歐陽樂平， 張善義， 李軍亮， 許新科， 翁胤侖， 鄭眉光， 王圣文， 李方成△

(中山大學孫逸仙紀念醫院神經外科，廣東 廣州 510120)

目的探討抗原提呈相關轉運蛋白1(TAP1)過表達對人膠質瘤細胞株U251人類白細胞抗原I(HLA-I)表達的影響。方法培養 U251細胞，構建慢病毒載體并轉染U251細胞，獲得穩定高表達TAP1的細胞株并設立轉染空載體對照組，分別收集U251細胞組、空載體對照組和TAP1基因轉染細胞組細胞的蛋白和RNA，行real-time PCR 和Western blotting分析過表達的TAP1對U251細胞HLA-I表達的影響，并用流式細胞術分析U251細胞HLA-I表面呈現的變化。結果成功建立TAP1高表達U251細胞株，TAP1 mRNA和蛋白分別升高(8.73±1.07)倍和(11.71±0.83)倍。高表達的TAP1促進U251細胞HLA-A、HLA-B、HLA-C(重鏈)和β2微球蛋白(輕鏈) mRNA表達上調，分別升高(3.51±0.36)倍、(4.78±0.85)倍、(2.94±0.28)倍和(3.23±0.24)倍, HLA-I蛋白表達升高(3.14±0.53)倍，同時U251細胞HLA-I的表面呈現明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)。結論過表達TAP1能促進U251細胞HLA-I表達及其在細胞表面呈現的提高。

神經膠質瘤； U251細胞； 抗原提呈相關轉運蛋白1； 人類白細胞抗原I

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，因其浸潤性生長，與正常腦組織分界不清，手術難以完全切除，且對放療、化療不敏感，治療效果一直不理想。利用免疫學方法，通過增強機體抗腫瘤免疫反應，達到清除腫瘤的目的，是一種常見的治療方式。抗原提呈系統(antigen-processing machinery, APM)是抗腫瘤免疫過程的重要組成部分，主要包括蛋白酶體復合物LMP2(low molecular mass polypeptide 2)/ LMP7(low molecular mass polypeptide 7)、抗原提呈相關轉運蛋白TAP1(transporter associated with antigen processing 1)/TAP2(transporter associated with antigen processing 2)和HLA-I(human leukocyte antigen I)等。腫瘤抗原在蛋白酶體復合物中降解、切割成適合T細胞識別的肽段，然后由抗原提呈相關轉運蛋白轉運到內質網中，經過進一步的修飾后結合到HLA-I分子上并呈現于細胞表面供CD8+T細胞識別，從而啟動特異性的抗腫瘤免疫反應。TAP1是抗原提呈系統的一個核心蛋白，當其表達異常時使抗原提呈的活性降低，同時影響HLA-I分子在細胞表面的呈現[1]。TAP1在包括膠質瘤在內的多種腫瘤中表達低下甚至缺失，且其表達水平與腫瘤的分期及預后密切相關。研究TAP1在抗原提呈系統中的表達及其在機體抗腫瘤免疫中的作用具有重要意義。本研究通過構建慢病毒包裝載體高表達TAP1，初步探討過表達的TAP1對U251膠質瘤細胞HLA-I表達及其表面呈現的影響。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

Lenti-X HTX 慢病毒包裝試劑盒、限制性內切酶(EcoR I和BamH I)、TaKaRa T4連接酶、細胞RNA提取試劑盒、實時熒光定量逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa。ECL 顯色液、DMEM 高糖培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和胰蛋白酶購自Invitrogen。10cm 細胞培養皿購自Corning。兔抗人TAP1、HLA-I、GAPDH多克隆IgG 抗體和羊抗兔IgGⅡ抗購于Abcam。慢病毒表達載體pSIN-EF2-IRES-GFP-puro和含有TAP1全長基因的GV230-TAP1質粒購自廣州賽業生物公司。U251細胞株和293T細胞購自中山大學動物實驗中心，大腸埃希菌菌株DH5α感受態購自天根公司。

2高表達TAP1的慢病毒載體構建

GV230-TAP1質粒與pSIN-EF2-IRES-GFP-puro 慢病毒載體分別經BamH I和EcoR I雙酶切，酶切充分后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳。紫外燈觀測分離片段，用Axygen 凝膠回收試劑盒回收。酶切產物TAP1片段及pSIN-EF2-IRES-GFP-puro混勻后，加TaKaRa T4 連接酶16 ℃連接過夜，并設立空載體對照組(不加入TAP1片段)。連接產物轉化DH5α感受態細菌，置于預熱后1 mL LB培養基內，并搖菌1 h。然后，取700 μL菌液離心，將沉淀用200 μL LB 培養基重懸，均勻涂布于含5 mg/L 嘌呤霉素的LB瓊脂平板上，待其吸收后，倒置平皿，37 ℃培養16 h。選取9個pSIN-EF2-IRES-GFP-puro-TAP1克隆細菌菌落(分別編號為1～9號)，搖菌過夜，提取質粒，分別用BamH I及EcoR I酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相，并將質粒送上海Invitrogen測序。酶切正確后的質粒轉染293T細胞。種植5×106個293T細胞于10 cm 平皿內，匯合度達70%時，按 Lenti-X HT 慢病毒包裝試劑盒說明，將pSIN-EF2-IRES-GFP-puro和psPAX、pMD2.G輔助質粒按慢病毒載體∶psPAX∶pMD2.G=4∶3∶1的比例轉染293T細胞，靜置于培養箱內。轉染8 h后首次換液，繼續換用含10%胎牛血清培養基培養，48 h后離心并分別收集上清，并用Millipore 公司0.45 μm孔徑醋酸纖維素膜濾器過濾、分裝(以上操作均在生物安全柜內操作)，-80 ℃冰箱凍存。

3慢病毒載體感染U251細胞

種植2×105個U251 細胞于6孔板內，種植3孔，1孔用于確定篩選藥物殺死正常對照細胞時間，另2孔用于感染病毒。分別用pSIN-EF2-IRES-GFP-puro載體和pSIN-EF2-TAP1-IRES-GFP-puro載體感染細胞。細胞感染24 h后，換用10%胎牛血清培養基培養。24 h后用含5 mg/L 嘌呤霉素10%胎牛血清培養基篩選細胞，直至正常對照細胞全部被殺死，得到穩定細胞株[2]。

4Real-time熒光定量PCR檢測

提取細胞總RNA，分光光度計測量RNA的純度及濃度，逆轉錄成 cDNA，采用SYBR Green染料法，用羅氏熒光PCR儀進行熒光PCR[3],反應條件如下：95 ℃變性2 min，以后每個循環條件為95 ℃ 10 s ，60 ℃ 10 s ，72 ℃ 30 s, 循環40次。引物序列如表1所示，以β-actin為內參照，通過 2-ΔΔCt方法進行相對定量分析。

表1 Real-time PCR引物序列

5Westernblotting分析

分別收集各組細胞，加入細胞裂解液及1%蛋白酶抑制劑提取蛋白，調整蛋白含量至各樣本蛋白濃度一致。采用10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟烯(PVDF)膜，5%牛血清白蛋白封閉，以兔抗人IgG I抗4 ℃搖床過夜，羊抗兔Ⅱ抗室溫孵育1 h，增強化學發光法顯影。以GAPDH為內參照。應用Bio-Rad 公司Quantity One分析軟件對顯影圖片進行相對定量分析。

6流式細胞術檢測細胞HLA-I的表面呈現

常規消化各組細胞，PBS洗滌3次。將各組細胞與兔抗人HLA-I在4 ℃ 孵育30 min，洗滌后與PE標記的羊抗兔Ⅱ抗孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞HLA-I的表面呈現。

7統計學處理

采用SPSS 16.0軟件分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示；多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1高表達TAP1的U251穩定細胞株的篩選及鑒定

U251細胞經嘌呤霉素篩選后熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光表現明顯，見圖1。行real-time PCR檢測，與未轉染組及空白對照組比較，轉染目的基因的細胞組TAP1 mRNA表達明顯升高，升高約(8.73±1.07)倍，見圖2；Western blotting檢測結果進一步證實，過表達組TAP1蛋白較未轉染組及空白對照組升高(11.71±0.83)倍，見圖3，而空載體轉染組TAP1蛋白無升高。Real-time PCR和Western blotting檢測結果表明，通過慢病毒載體介導，能有效地將TAP1基因導入U251膠質瘤細胞，并使其在mRNA和蛋白水平持續穩定高表達。

Figure 1. Transfection efficiency ofTAP1 gene in U251 cells under fluorescence microscope(×100). A1: U251 cells under white light; A2: U251 cells under purple fluorescence; B1: lenti-control under white light; B2: lenti-control under purple fluorescence; C1: lenti-TAP1 under white light; C2: lenti-TAP1 under purple fluorescence.

圖1熒光顯微鏡下細胞綠色熒光蛋白的表達情況

Figure 2. Overexpression of TAP1 mRNA in transfected U251 cells detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 or lenti-control.

圖2Real-timePCR檢測3組細胞TAP1mRNA表達情況

Figure 3. Expression of TAP1 protein in transfected U251 cells detected by Western blotting analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 or lenti-control.

圖3Westernblotting檢測3組細胞TAP1蛋白的表達

2TAP1轉染對U251細胞HLA-I表達的影響

Real-time PCR 分析顯示，轉染TAP1基因組細胞HLA-A、HLA-B、HLA-C和β2微球蛋白 mRNA水平分別較未轉染組及空載體組升高(3.51±0.36)倍、(4.78±0.85)倍、(2.94±0.28)倍和(3.23±0.24)倍，見圖4，空載體組與未轉染組的表達水平未見明顯差異。Western blotting實驗顯示，轉染TAP1基因后，U251細胞HLA-I蛋白表達升高(3.14±0.53)倍，見圖5。

Figure 4. The expression of HLA-A, HLA-B, HLA-C and β2M mRNA in the three groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 or lenti-control.

圖4Real-timePCR檢測3組細胞HLA-A、HLA-B、HLA-C和β2微球蛋白mRNA的表達

3過表達的TAP1對細胞HLA-I表面呈現的影響

流式細胞術結果顯示，U251細胞低呈現HLA-I，轉染TAP1基因后，U251細胞表面HLA-I的呈現較未轉染組與空載體組均明顯增多，HLA-I陽性細胞數升高了(4.13±0.76)倍，差異有統計學意義(P<0.05)。未轉染組與空載體組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見圖6。

Figure 5. Expression of HLA-I protein in the three groups detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 or lenti-control.

圖5Westernblotting檢測3組細胞HLA-I蛋白的表達

Figure 6. Up-regulated TAP1 increased the surface expression of HLA class I in U251 cells.

圖6流式細胞術檢測各組細胞表面HLA-I的表達

討 論

抗腫瘤反應的關鍵在于激活CD8+T細胞，CD8+T細胞的活化依賴于其識別由細胞表面HLA-I分子提供的抗原肽。HLA-I分子是由重鏈(α鏈)和輕鏈(β鏈)經共價鍵連接成的異二聚體，α鏈主要由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因編碼，β鏈即β2微球蛋白。細胞膜上HLA-I分子表達需要α鏈和β鏈同時存在[4]。在腫瘤逃避機體免疫監視的機制中，HLA-I表達異常是常見的原因。有研究顯示，HLA-I類分子在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、小細胞肺癌等多種腫瘤中部分或整體表達低下或缺如，導致機體抗腫瘤反應的缺失，相似的報告亦見于膠質瘤[5]。影響HLA-I表達的因素眾多，抗原提呈相關轉運蛋白表達的下調或缺失是常見的原因[6]。抗原提呈相關轉運蛋白是由TAP1/TAP2組成的二聚體復合物，跨膜鑲嵌在內質網膜上，將蛋白酶體降解的肽段由細胞液中轉運到內質網中的空HLA-I分子上從而啟動特異性的細胞免疫反應， 在這一過程中，TAP1發揮著主要的作用[7]。有研究顯示，IFN-λ在上調TAP1后能進一步導致HLA-I表達的增加[8]。在黑色素瘤中，通過導入TAP1基因可有效地重建HLA-I在腫瘤細胞表面的呈現從而啟動特異性的抗腫瘤免疫反應[9]。在膠質瘤中，TAP1和HLA-I常表達低下或二者表達協同缺失。鑒于此，我們通過構建TAP1慢病毒載體并轉染膠質瘤U251細胞，對TAP1和HLA-I的關系進行初步研究。

慢病毒載體是近年發展起來的基因轉移載體，介導的基因轉移可以整合入宿主的基因組中，具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發宿主免疫反應等優點[10]。我們在實驗中成功地構建TAP1慢病毒載體，并感染膠質瘤U251細胞，經過PCR和Western blotting證實，TAP1 mRNA及蛋白穩定高表達。隨后，我們進一步檢測了過表達的TAP1對U251細胞HLA-I類分子表達的影響，結果發現，TAP1轉染組HLA-A、B、C和β2微球蛋白在mRNA水平表達明顯增加。同時，我們利用Western blotting和流式細胞術對HLA-I蛋白進行檢測發現，HLA-I蛋白表達水平同樣升高，其在細胞表面的呈現較未轉染組及空載體轉染組皆明顯上調，證明過表達的TAP1能夠上調膠質瘤細胞HLA-I的表達及其在細胞表面的呈現。

TAP1上調HLA-I的機制尚不清楚。HLA-I α鏈與β2微球蛋白組裝成HLA-I分子并呈現于細胞表面時需要與適當的抗原結合，當缺少TAP1時，細胞不能提供足夠的抗原，HLA-I α鏈與β2微球蛋白變得不穩定并且很快被降解，導致HLA-I表面呈現的降低甚至缺失[11]。過表達的TAP1可能通過提呈足夠抗原肽而使HLA-I更多地呈現于細胞表面。此外，TAP1基因與HLA-I基因位于基因組的相鄰區域，且二者同時進化，該區域基因編碼的蛋白超過40%參與了免疫反應[12]。TAP1有可能通過某種內在聯系調節HLA-I的表達。

我們在前期研究中發現[13-16]，TAP1與膠質瘤分級密切相關，其表達水平隨膠質瘤分級增加表達下降。光動力處理后膠質瘤細胞的LMP2、LMP7、TAP1和HLA-I表達均上調，且用酸洗法制備的樹突狀細胞疫苗作用于光動力處理后的膠質瘤細胞，發現其抗腫瘤活性明顯提高。構建TAP1慢病毒載體，對于研究抗原提呈系統在腫瘤免疫中的作用具有重要意義，同時也為我們的后續研究打下堅實的基礎。

[1] Lankat-Buttgereit B, Tampé R. The transporter associated with antigen processing: function and implications in human diseases[J]. Physiol Rev,2002,82(1):187-204.

[2] 曾憲成，張 彤，李 華，等. 肝癌Hep3B細胞HLA-G過表達對NK細胞體外殺傷作用的影響[J]. 中國病理生理雜志,2012,28(4):613-618.

[3] 張 彤，曾憲成，李 華，等. HLA-E在肝癌細胞系中的表達[J]. 中國病理生理雜志,2012,28(10):1884-1886.

[4] Charron D. Immunogenetics today: HLA, MHC and much more[J]. Curr Opin Immunol,2005,17(5):493-497.

[5] Satoh E, Mabuchi T, Satoh H, et al. Reduced expression of the transporter associated with antigen processing 1 molecule in malignant glioma cells, and its restoration by interferon-γ and-β[J]. J Neurosurg,2006,104(2):264-271.

[6] Kaczmarek M, Frydrychowicz M, Rubis B, et al. Analysis of expression of MHC class I molecules and TAP genes in malignant human cell lines[J]. Folia Histochem Cytobiol,2007,45(3):205-214.

[7] Alimonti J, Zhang QJ, Gabathuler R, et al. TAP expression provides a general method for improving the recognition of malignant cellsinvivo[J]. Nat Biotechnol,2000,18(5):515-520.

[8] Ma W, Lehner PJ, Cresswell P, et al. Interferon-γ rapidly increases peptide transporter (TAP) subunit expression and peptide transport capacity in endothelial cells[J]. J Biol Chem,1997,272(26):16585-16590.

[9] Tao J, Li Y, Liu YQ, et al. Restoration of the expression of transports associated with antigen processing in human malignant melanoma increases tumor-specific immunity[J]. J Invest Dermatol,2008,128(8):1991-1996.

[10] Bartosch B, Cosset FL. Strategies for retargeted gene delivery using vectors derived from lentiviruses[J]. Curr Gene Ther,2004,4(4):427-443.

[11] Restifo NP, Esquivel F, Kawakami Y, et al. Identification of human cancers deficient in antigen processing[J]. J Exp Med,1993,177(2):265-272.

[12] Flajnik MF, Kasahara M. Comparative genomics of the MHC: glimpses into the evolution of the adaptive immune system[J]. Immunity,2001,15(3):351-362.

[13] 李方成，張善義，李軍亮，等. 人類白細胞抗原Ⅰ類抗原轉運相關蛋白1在膠質瘤組織中的表達及其與抗原轉運相關蛋白-2的關系[J]. 中華實驗外科雜志,2012,29(4):682-684.

[14] Yuan S, Sun X,Zhang S, et al. Antitumor efficacy of a photodynamic therapy-generated dendritic cell glioma vaccine[J]. Med Oncol,2011,28(Suppl 1):S453-S461.

[15] Zhang SY, Li JL, Xu XK, et al. HMME-based PDT restores expression and function of transporter associated with antigen processing 1 (TAP1) and surface presentation of MHC class I antigen in human glioma[J]. J Neurooncol,2011,105(2):199-210.

[16] 溫鋮彩，李軍亮，張善義，等. 鹽酸氨基酮戊酸介導的光動力療法增高U251細胞蛋白酶體的表達[J]. 中國臨床神經外科雜志,2012,17(3): 154-157.

OverexpressionofTAP1up-regulatesHLA-ΙinhumangliomaU251cells

OUYANG Le-ping, ZHANG Shan-yi, LI Jun-liang, XU Xin-ke, WENG Yin-lun, ZHENG Mei-guang, WANG Sheng-wen, LI Fang-cheng

(DepartmentofNeurosurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:lifangcheng001@163.com)

AIM: To investigate the relationship between the overexpression of transporter associated with antigen processing 1 (TAP1) and the human leukocyte antigen I (HLA-I).METHODSThe full length ofTAP1 gene was obtained from the cDNA library. The lentiviral vector pSIN-EF2-IRES-GFP-puro was digested byBamH I andEcoR I, and the full length ofTAP1 gene was inserted into the vector by T4 DNA ligase. Subsequently, the recombinant plasmid was transformed intoEscherichiacoliDH5α cells and the correct transformant was selected. The recombinant plasmid and the Lenti-X HTX packaging mixture were co-transfected into 293T cells, and the virus particle was acquired. Human glioma U251 cells were transfected with the lentivirus. The expression of TAP1 and HLA-I was determined by real-time fluorescence quantitative PCR, Western blotting and flow cytometric analysis.RESULTSTAP1 gene was successfully transfected into the U251 cells and stably expressed in the cell line. The expression of TAP1 in U251 cells at mRNA and protein levels increased by (8.73±1.07) and (11.71±0.83) folds, respectively. As a result, the mRNA expression of HLA-A, HLA-B, HLA-C (heavy chain) and β2-microglobulin (light chain) was up-regulated by (3.51±0.36), (4.78±0.85), (2.94±0.28) and (3.23±0.24) folds, respectively. The protein expression of HLA-I also increased to (3.14±0.53) fold. The surface expression of HLA-I on the U251 cells transfected withTAP1 gene was largely enhanced as well.CONCLUSIONOverexpression of TAP1 up-regulates the expression of HLA-I. TAP1 plays an important role in HLA-I processing pathway.

Glioma; U251 cells; Transporter associated with antigen processing 1; Human leukocyte antigen I

R363

A

1000- 4718(2013)03- 0425- 05

2012- 10- 12

2013- 01- 07

國家自然科學基金資助項目(No.81072081)

△通訊作者 Tel： 020-81332013; E-mail： lifangcheng001@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.03.008