枸櫞酸鐵銨通過(guò)提高ROS水平激活MAPK通路并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡*

曹軍軍， 楊茂偉， 郭寶磊， 梁 單

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

枸櫞酸鐵銨通過(guò)提高ROS水平激活MAPK通路并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡*

曹軍軍， 楊茂偉△， 郭寶磊， 梁 單

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

目的探討鐵超載提高人成骨細(xì)胞(hFOB1.19)活性氧(ROS)水平在激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用。方法采用細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)成骨細(xì)胞hFOB1.19，將不同濃度枸櫞酸鐵銨(100、300、500 μmol/L)加入細(xì)胞培養(yǎng)基，用MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖活性；DCFH-DA熒光探針檢測(cè)成骨細(xì)胞ROS水平；Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western blotting檢測(cè)MAPK通路相關(guān)蛋白。結(jié)果枸櫞酸鐵銨處理成骨細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性明顯降低，早期凋亡和總死亡率顯著增加；不同濃度的枸櫞酸鐵銨處理成骨細(xì)胞后，其ROS水平分別增高至(35.73±2.52)%、(62.89±4.24)%和(76.06±3.55)%，MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)也明顯增加并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可以在降低ROS水平及MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的同時(shí)抑制枸櫞酸鐵銨所致的細(xì)胞凋亡。結(jié)論枸櫞酸鐵銨能使成骨細(xì)胞增殖受到抑制，并且通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，激活MAPK通路，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。

鐵； 成骨細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 活性氧； MAPK信號(hào)通路

鐵是人體必需營(yíng)養(yǎng)元素，廣泛參與機(jī)體生理功能和生化反應(yīng)[1]。當(dāng)罹患血色素沉著病等疾病時(shí)，機(jī)體內(nèi)過(guò)多的鐵可引起骨量減少，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[2]。同時(shí)，骨組織年齡相關(guān)的鐵沉積與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有關(guān)[3]。這些都證實(shí)了鐵超載與骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系。相關(guān)研究表明，枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC)可以通過(guò)增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平和激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(caspase-3)從而引起成骨細(xì)胞存活率的降低，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[3]。但鐵超載通過(guò)何種途徑引起的成骨細(xì)胞數(shù)量減少，目前仍不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用FAC干預(yù)細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及與其相關(guān)的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的激活，初步探討鐵超載所致成骨細(xì)胞毒性的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

人成骨細(xì)胞株hFOB1.19購(gòu)自美國(guó)培養(yǎng)物保存中心(ATCC，CRL-2593)，DMEM(高糖)/F12培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)于HyClone，噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和FAC購(gòu)于Sigma，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinases, ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK) 抗體購(gòu)于Santa Cruz，p38 抗體購(gòu)于CST，抗鼠和抗兔Ⅱ抗購(gòu)于北京中杉公司。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC) 購(gòu)于碧云天公司， 2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯( 2’，7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA) 購(gòu)于Molecular Probes。

2細(xì)胞培養(yǎng)

人hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、0.3 g/L G418、DMEM(高糖)/F12=1∶1的培養(yǎng)基當(dāng)中，置于34 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶常規(guī)消化傳代。實(shí)驗(yàn)分為4組：正常組、FAC100、300、500 μmol/L組。將上述濃度的FAC加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，正常組加入不含F(xiàn)AC的培養(yǎng)基。

3細(xì)胞體外生長(zhǎng)活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hFOB1.19細(xì)胞，以5×107/L密度接種于96孔板當(dāng)中(100 μL/well)，培養(yǎng)24、48、72 h后，加入不同濃度枸櫞酸鐵銨的培養(yǎng)基(100 μL/well)，使枸櫞酸鐵銨終濃度為0、50、100、150、300、500、800、1 200、1 500 μmol/L，重復(fù)設(shè)置6孔加藥作用24、48、72 h后棄掉培養(yǎng)基，向每孔分別加入20 μL 5 g/L MTT儲(chǔ)存液，并于37 ℃孵育4 h吸出MTT后，向每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，按照抑制率(%) =(A570正常-A570加藥)/A570正常×100%，計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

4細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hFOB1.19細(xì)胞，接種于100 mm培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24 h后，加藥作用24 h。離心收集細(xì)胞，用冰凍的PBS洗細(xì)胞2次。用200 μL binding buffer重懸細(xì)胞后，加入10 μL Annexin V，避光4 ℃ 孵育30 min，再加入100 μL binding buffer混勻后加入5 μL PI染液，避光4 ℃ 孵育5 min，流式細(xì)胞儀(FACSCalibur, Becton-Dickinson)進(jìn)行檢測(cè)，CellQuestTM軟件 (Becton-Dickinson)進(jìn)行分析。Annexin V+PI-標(biāo)記為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+PI+標(biāo)記為晚期凋亡以及壞死細(xì)胞，細(xì)胞相對(duì)凋亡率(%)=處理組凋亡率/正常組凋亡率×100%。

5細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)

細(xì)胞內(nèi)ROS水平采用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hFOB1.19細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中。在含10%FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，加入FAC進(jìn)行處理，羰酰氰基對(duì)氯苯脘(carbonyl cyanide-chlorophenylhydrazone，CCCP)作為陽(yáng)性對(duì)照。使用無(wú)血清的培養(yǎng)基洗2次后，加入20 μmol/L DCFH-DA于37 ℃孵育1 h，每5 min振蕩細(xì)胞1次。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，CellQuestTM軟件分析并計(jì)算ROS陽(yáng)性率。

6Westernblotting檢測(cè)MAPK途徑相關(guān)蛋白

將培養(yǎng)的hFOB1.19細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2次，刮落細(xì)胞后1 000 r/min 離心5 min；每組加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上放置30 min，超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞。用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白含量。取適量樣品，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用甲醇活化10 s后，在電轉(zhuǎn)移架上恒流200 mA轉(zhuǎn)移(90～120 min)。PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h。Ⅰ抗按1∶400～1∶1 000進(jìn)行稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000)封閉2 h后，用增強(qiáng)型化學(xué)免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)(ECL)檢測(cè)免疫反應(yīng)蛋白。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1枸櫞酸鐵銨對(duì)hFOB1.19細(xì)胞增殖的抑制

枸櫞酸鐵銨對(duì)hFOB1.19細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)圖1。24、48和72 h的IC50分別為247 μmol/L、176 μmol/L和158 μmol/L。

Figure 1. Cell proliferation detected by MTT assay after FAC treatment.Mean±SD.n=3. The curves showed dose-effect relationship. The half maximal (50%) inhibitory concentrations were 247 μmol/L，176 μmol/L and 158 μmol/L for 24 h, 48 h and 72 h, respectively.

圖1MTT檢測(cè)枸櫞酸鐵銨對(duì)hFOB1.19細(xì)胞增殖的影響

2構(gòu)櫞酸鐵銨可顯著提高h(yuǎn)FOB1.19細(xì)胞內(nèi)的ROS水平

不同濃度的枸櫞酸鐵銨作用于hFOB1.19細(xì)胞24 h后，ROS水平與對(duì)照組相比明顯升高，熒光波峰向右遷移，呈濃度依賴(lài)性，見(jiàn)圖2A。與正常組相比，不同濃度的枸櫞酸鐵銨作用于hFOB 1.19細(xì)胞24 h后，ROS陽(yáng)性率明顯增加(P<0.01),見(jiàn)圖2B，分別由正常組的(8.34±1.30)%增加到FAC 100 μmol/L組的(35.73±2.52)%、FAC 300 μmol/L組的(62.89±4.24)%和FAC 500 μmol/L組的(76.06±3.55)%。加入抗氧化劑NAC后，ROS陽(yáng)性率明顯降低(P<0.01)，為(10.1±1.5)%，與正常組相比無(wú)明顯差別。

3枸櫞酸鐵銨可以通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平誘導(dǎo)hFOB1.19細(xì)胞凋亡

與正常組相比，不同濃度的枸櫞酸鐵銨作用于hFOB1.19細(xì)胞24 h后，細(xì)胞早期凋亡和總凋亡均明顯增加(P<0.01)，早期凋亡分別由正常組的(5.03±1.09)%，增加到FAC 100 μmol/L組的(8.98±3.33)%、FAC 300 μmol/L組的(19.31±9.12)%和FAC 500 μmol/L組的(28.93±7.72)%。加入抗氧化劑NAC后，細(xì)胞早期凋亡和總凋亡率均降低(P<0.01)，與正常組比無(wú)明顯差別，見(jiàn)圖3。

4枸櫞酸鐵銨激活hFOB1.19細(xì)胞內(nèi)的MAPK通路

與對(duì)照組相比，不同濃度枸櫞酸鐵銨作用hFOB1.19細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)的p-ERK1/2、p-p38以及p-JNK表達(dá)明顯增加(P<0.01)，見(jiàn)圖4。加入抗氧化劑NAC后，細(xì)胞內(nèi)的p-ERK1/2、p-p38以及p-JNK表達(dá)均降低(P<0.01)，與正常組比無(wú)明顯差別。

Figure 2. FAC increased the ROS level in hFOB1.19 cells. The ROS level was measured by flow cytometry analysis in hFOB1.19 cells stained with DCFH-DA.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol or 300 μmol/L FAC+NAC.

圖2枸櫞酸鐵銨顯著提高h(yuǎn)FOB1.19細(xì)胞內(nèi)的ROS水平

討 論

骨質(zhì)疏松是血色素沉著病等疾病的重要并發(fā)癥，同時(shí)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松伴隨著骨骼鐵的沉積[2,4]，這些都說(shuō)明了體內(nèi)高鐵與骨質(zhì)疏松的相互關(guān)系，但高鐵所引起骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制目前尚不清楚。

骨質(zhì)疏松主要與骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡破壞有關(guān)。其中骨的形成和吸收分別由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞完成[5]。成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性決定了骨形成水平。成骨細(xì)胞的凋亡可以導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨形成降低[6]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，高鐵可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的枸櫞酸鐵銨可以引起成骨細(xì)胞活性的降低和成骨細(xì)胞凋亡的增加。

Figure 3. The apoptosis of hFOB1.19 cells detected by Annexin V/PI staining after FAC treatment.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol or 300 μmol/L FAC+NAC.

圖3枸櫞酸鐵銨通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)hFOB1.19細(xì)胞凋亡

Figure 4. The expression of the proteins in MAPK signaling pathways.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol or 300 μmol/L FAC+NAC.

圖4枸櫞酸鐵銨激活hFOB1.19細(xì)胞內(nèi)的MAPK通路

鐵作為催化劑會(huì)產(chǎn)生大量的ROS[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的枸櫞酸鐵銨可以引起hFOB1.19細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加，而加入抗氧化劑后ROS的水平明顯降低，并且細(xì)胞凋亡率明顯減少，這說(shuō)明了，高鐵可以通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。ROS是具有高度反應(yīng)活性的基團(tuán)，能夠促進(jìn)蛋白氧化，膜脂質(zhì)過(guò)氧化以及核酸改變[9]。

ROS可以通過(guò)多種途徑引起細(xì)胞凋亡[10-11]。其中MAPK級(jí)聯(lián)通路是重要的調(diào)節(jié)通路[12]。細(xì)胞運(yùn)用這一系統(tǒng)將胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞核，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡等一系列生理病理過(guò)程[13]。其中ERK1/2、JNK和p38蛋白對(duì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)很敏感[14-15]。我們發(fā)現(xiàn)高濃度枸櫞酸鐵銨作用成骨細(xì)胞24 h后，磷酸化的ERK1/2、JNK和p38明顯增加，說(shuō)明了高鐵可以激活MAPK通路從而引起成骨細(xì)胞凋亡。而加入抗氧化劑NAC后，ERK1/2、JNK、p38蛋白的磷酸化明顯減少，證明高鐵所引起的MAPK通路的激活可能是由于ROS水平的升高所引起的。

綜上所述，鐵超載可以hFOB1.19細(xì)胞增加細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，并且激活氧化應(yīng)激相關(guān)MAPK通路蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)hFOB1.19細(xì)胞凋亡。

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OverloadofferricammoniumcitratetriggersMAPKpathwaysbyproducinghighlevelofreactiveoxygenspeciesandinducesapoptosisofhumanhFOB1.19osteoblastcells

CAO Jun-jun, YANG Mao-wei, GUO Bao-lei, LIANG Dan

(DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:ymw69@sohu.com)

AIM: To investigate the role of reative oxygen species (ROS) generated by iron overload in activating the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways and apoptosis.METHODSCultured human osteoblast cell line hFOB1.19 was treated with ferric ammonium citrate (FAC) at concentrations of 0～500 μmoL/L. The proliferation of hFOB1.19 cells was analyzed by MTT assay. Apoptosis was detected by flow cytometry with Annexin V/PI staining. The expression levels of p-ERK, p-JNK and p-p38 were determined by Western blotting 24 h after treatment with FAC.RESULTSAfter treated with FAC, the cell proliferation was inhibited. The early apoptosis and total cell death were significantly increased. The levels of ROS were increased to (35.73±2.52)%, (62.89±4.24)% and (76.06±3.55)% with the increasing doses of FAC treatmen,respectively. The expression levels of p-ERK, p-JNK and p-p38 were also remarkably elevated in FAC groups.CONCLUSIONIron overload increases intracellular ROS level, thus triggering the MAPK pathways and inducing apoptosis of human hFOB1.19 osteoblast cells.

Iron; Osteoblast; Apoptosis; Reactive oxygen species; MAPK signaling pathways

R363.2+1

A

1000- 4718(2013)03- 0476- 05

2012- 08- 31

2013- 01- 22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81170808)

△通訊作者 Tel: 024-81359668; E-mail: ymw69@sohu.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.03.016