鼠平臺骨折術后活血補腎藥物對軟骨退變相關因子的影響

林梓凌，曾建春，樊粵光，黃永明，孫鴻濤，曾意榮，趙京濤

(廣州中醫藥大學第一附屬醫院骨科，廣州 510405)

創傷性骨關節炎是骨性關節炎的一種類型［1］，由骨關節創傷骨折后等原因引起。為探討運用中醫活血補腎方藥，能否有效影響關節骨折術后的軟骨損害病變相關因子，抑制軟骨退變，我們通過動物實驗進行了以下觀察研究。

1 實驗與用藥

1.1 實驗準備

選擇成年雌性SD大鼠40只(廣州中醫藥大學動物實驗中心提供)，體質量約0.35 ～0.45 kg，隨機分成正常組、中藥觀察組、對照觀察組和空白組，每組10只。

1.2 動物造模

除空白組外均進行雙側造模。以質量分數2.5% 的硫賁妥鈉(2 ml/kg體質量)腹腔內注射麻醉，術區消毒后，無菌狀態下于脛骨結節外側切開顯露脛骨近端，以微型骨鑿縱行劈開脛骨平臺外側髁。復位后，自大鼠脛骨平臺外側插入一枚事先消毒好直徑0.8mm的克氏針，平行關節面橫穿脛骨平臺，針尾彎曲埋于平臺皮下。術后不限制活動，10萬級無菌動物實驗室分籠飼養，動物飼養室溫度為20±1℃，濕度為55±2%。

1.3 藥物準備

中藥觀察組給予活血補腎方(關節康組方加減)［2］湯劑口服(廣州中醫藥大學第一附屬醫院煎藥室提供)。原方由熟地、川牛膝、杜仲、丹參、川芎、獨活、紅花、木瓜、木香、補骨脂等藥物組成［2］。前5d加桃仁、赤芍、當歸，原方熟地改為生地，5d后原方加骨碎補、枸杞子。

對照觀察組給予口服西樂葆，每日1次。空白組給予生理鹽水，每日1次。所有藥物均按體表面積折算動物的等效劑量，再用生理鹽水配成每天4ml溶液灌胃。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 標本采集 分別于術后3d、7d及21d大鼠眼角取血，離心后取上清液置－70℃保存待測。

1.4.2 TNF-а水平及MMP-3濃度檢測 采用雙抗體夾心ELISA法，實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.4.3 NO測定 用硝酸還原酶法，測定方法參照試劑盒內說明書進行。

1.4.4 統計學方法 采用 SPSS 13.0軟件進行統計學處理，組間均數比較行t檢驗，P＜0.05為有統計學意義，用雙變量相關分析法分析患者與血清中MMP-3、TNF-а之間的關系。

2 結果

2.1 大鼠血清中TNF-а、MMP-3水平檢測結果

表1、2顯示，3d中藥觀察組、空白組及對照觀察組血清TNF-а、MMP-3水平顯著高于空白組(P＜0.01)。中藥觀察組、空白組及對照觀察組3d、7d和21dTNF-а水平有逐漸升高趨勢，兩兩比較差異有統計學意義(P＜0.01);空白組3d、7d和21d MMP-3水平同樣呈逐漸升高趨勢，兩兩比較差異有統計學意義(P＜0.01);但是中藥觀察組和對照觀察組MMP-3的3d和7d TNF-а水平雖然也有升高趨勢，兩兩比較差異無統計學意義 (P＞0.05)，而7d和21d則差異有統計學意義(P＜0.01)。同時在7d和21d的對比中，空白組血清TNF-а、MMP-3水平顯著高于中藥觀察組 (P＜0.01)。而對照觀察組在7d時與中藥觀察組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，與空白組比較差異明顯(P＜0.01);反之，21d時對照觀察組與中藥觀察組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，與空白組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。

2.2 大鼠血清NO濃度檢測結果

表3顯示，3d中藥觀察組、空白組及對照觀察組血清NO濃度水平顯著高于空白組 (P＜0.05)。空白組3d、7d和21dNO濃度同樣呈逐漸升高趨勢，兩兩比較差異有統計學意義 (P＜0.05);但是中藥觀察組和對照觀察組NO濃度的3d和7d雖然也有升高趨勢，但兩兩比較差異無統計學意義 (P＞0.05)，而7d和21d差異則有統計學意義(P＜0.05)。同時在7d和21d的比較中，空白組血清NO濃度顯著高于中藥觀察組 (P＜0.05)，而對照觀察組在7d時與中藥觀察組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，與空白組比較差異明顯(P＜0.05);反之，21d時對照觀察組與中藥觀察組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，與空白組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表1 血清TNF-а水平比較(pg/ml)

表2 血清MMP-3水平比較(ng/ml)

表3 大鼠血清中NO濃度比較

3 討論

高能量損傷骨折致關節軟骨的破壞及退變，是創傷性關節炎的主要病理變化。

脛骨平臺骨折屬中醫“骨折”范疇，而內固定術后創傷性關節炎的產生、功能障礙可歸屬痹證等范疇。骨折外傷，脈絡受阻，氣滯則痛，血瘀則腫，致使氣滯血瘀、氣血不通、榮養不利則關節屈伸不靈，活動受限。骨折恢復期肝腎氣血主之，肝腎虧虛、筋骨失養則恢復緩慢，失榮則痛，所謂“膝痛無有不因肝腎虛者”也，因此氣血瘀阻、肝腎虧虛乃是平臺骨折術后關節軟骨修復愈合階段的主要表現。

應用活血補腎方藥治療骨關節炎相關研究證實［3］，軟骨退變有良好的防治作用。如活血藥當歸、川芎和丹參能有效降低骨性關節炎中炎癥因子水平，保護和促進軟骨細胞修復，防治關節軟骨退變［4～8］。應用活血補腎方藥在動物實驗中證明有一定的鎮痛作用，能減輕藥物損傷所致大鼠足跖腫脹的作用及部分抗炎功效［9］。

在補腎藥物方面，汪青春等［10，11］發現補腎方藥對延緩軟骨降解效果較好，可增強SOD的活性，降低血清HA水平，抑制軟骨GAG的降解，輕度下調關節軟骨IL-、iNOS的基因表達，對IL-6有輕度上調作用;且能增加軟骨細胞功能，對受破壞的軟骨修復似有一定作用。曾意榮等認為［12］，活血補腎復方中藥能顯著降低膝骨關節炎患者血清MMP-3的水平，間接預防II型膠原總量丟失，顯著降低膝骨關節炎患者血清IL-1水平，顯著降低膝骨關節炎患者血清透明質酸水平，顯著提高超氧化物歧化酶活性，降低乳過氧化物酶活性，清除氧自由基。

通過我們的動物實驗可見，關節骨折術后早期，運用活血補腎方藥的中藥觀察組血清MMP-3水平顯著低于對照組，可以認為活血補腎方藥能在治療早期便有效抑制MMP-3水平的增高。而在中期，中藥觀察組血清TNF-а、MMP-3和NO的水平均顯著低于對照組，說明應用活血補腎法的中藥觀察組對這期間相關檢測因子指標的水平增長能有效抑制。TNF-a、MMP-3和NO等因子都是關節軟骨損害過程中重要的誘發、介導因子，它們在血清和關節液中的濃度水平高低，可反映關節軟骨退變發生、發展的進程。因此，根據動物實驗室檢驗結果發現，中藥觀察組對關節骨折固定術后的血清TNF-a、MMP-3和NO水平增長能有效抑制，證明運用活血補腎方藥辨證施治用藥，能有效防治關節骨折術后軟骨退變進程。

綜上研究所示，辨證應用活血補腎藥物對于抑制脛骨平臺骨折術后關節軟骨退變進程的相關因子水平，防治創傷性關節炎的發生發展產生了積極有利的影響。

［1］ 許學猛，王羽豐，鄧晉豐，等.活血補腎膠囊影響兔膝關節退行性疾病骨內高壓變化的實驗研究［J］.中國中醫骨傷科雜志，2001，9(4):24-26.

［2］ 周斌，樊粵光，曾意榮.中藥關節康治療膝骨性關節炎的臨床研究［J］.廣州中醫藥大學學報，2006，23(6):476-480.

［3］ 許學猛，王羽豐，鄧晉豐，等.活血補腎膠囊影響兔膝關節退行性疾病骨內高壓變化的實驗研究［J］.中國中醫骨傷科雜志，2001，9(4):24-26.

［4］ 王文璜，劉宏澤，衛小春，等.川芎嗪防治膝關節軟骨退變的實驗研究［J］.中國骨傷，2004，17(2):80-83.

［5］ 晏雪生，彭亞琴，明安萍.川芎嗪注射液對體外培養軟骨細胞影響的實驗研究［J］.中國中醫骨傷科雜志，2002，10(1):51-54.

［6］ 呂紅斌，岳珍，王嘉美，等.四種中藥對體外培養兔關節軟骨細胞代謝的影響［J］.中國運動醫學雜志，1995，14(3):135-138.

［7］ 王耶，劉建宇，宋艷，等.丹參和透明質酸鈉注射液對骨性關節炎治療作用的實驗研究［J］.中國生化藥物雜志，1998，19(5):248-251.

［8］ 王秀華，劉元祿，蘇姿兵，等.丹參關節內注射對兔膝骨關節炎細胞因子 IL-I及 TNF的影響［J］.中醫正骨，2003，15(10):1-4.

［9］ 王麗新，鄒衍衍，樊粵光.關節康片的抗炎鎮痛作用及毒性觀察［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16(6):417-420.

［10］ 汪青春，董蕙芳，沈墻芝，等.中藥對膝骨關節炎黑鼠血清SOD、HA、NO 水平的影響［J］.中醫正骨，1999，11(5):6-8.

［11］ 汪青春，石印玉，沈墻芝，等.中藥對膝骨關節炎小鼠關節軟骨IL-I、NOS基因表達的影響［J］.山西醫藥雜志，1999，28(5):381-384.

［12］ 曾意榮，樊粵光，吳凡，等.膝骨關節炎患者血清基質金屬蛋白酶3、腫瘤壞死因子Q、白細胞介素1、透明質酸、脂質過氧化物含量及超氧化物歧化酶活性變化與活血補腎中藥的干預［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(28):2436-2439.