黃芪桂枝五物湯對STZ誘發糖尿病大鼠周圍神經保護作用

齊 峰，邱昌龍，朱 亮，趙 舒，楊小溪

(河北聯合大學中醫學院，河北唐山 063000)

糖尿病累及周圍神經系統可產生糖尿病周圍神經病變(Diabetic Peripheral Neuropathy DPN)，而且可隨病程的延長而加重，是糖尿病致殘、致死的主要原因之一［1］。黃芪桂枝五物湯是我們臨床常用的治療DPN基本處方之一，且近年來因其療效確切而屢見報道［2～5］。為進一步探明其作用效果和機制，我們開展了如下研究。

1 材料與方法

1.1 動物

8周齡健康雄性Wistar大鼠，體質量200～220g(SCXK(京)2011-0005)，由河北聯合大學實驗動物中心代購。

1.2 藥物

黃芪桂枝五物湯:黃芪15g，桂枝 15g，白芍15g，生姜30g，大棗4枚(15g)組成，成人每日處方生藥量為 90g。藥材加水 300ml，浸泡 30min，煎30min，二煎加水200ml，煎20min，將2次煎汁混勻，水浴濃縮為165%(1ml含1.65g生藥)的藥液，4℃保存備用。所需藥材從北京同仁堂唐山分部一次性購買;彌可保片(080626)500ug/，日本衛材(中國)藥物有限公司。

2.2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(STZ):sigma公司產品(lg/瓶，批號S0130);NGF(免疫組化試劑盒)，北京博奧森生物科技公司;JT502N電子天平:上海倫捷;SZ-97自動三重純水蒸餾器:上海亞榮生化儀器廠。

1.3 溶液配置

檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH值4.2～4.5)的配置:取2.1g檸檬酸加入雙蒸水100ml配成A液，取2.94g檸檬酸鈉加入雙蒸水100ml配成B液。用時將A、B液按1∶1.32比例混合，pH計測定pH值，調節pH=4.2～4.5，即是所需配置STZ的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液，現配現用。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物造模與分組 選取8周齡健康雄性Wisart大鼠，體質量200～220g，自然光線，不限制飲水，適應性喂養l周后禁食12h，將鏈脲佐菌素用0.1mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.2，4℃)避光條件下配成1%濃度溶液，按50mg/kg劑量左下腹腔內單次注射，72h后尾靜脈取血測血糖，凡血糖≥16.7mmol/L作為糖尿病大鼠。將50只糖尿病大鼠隨機分為模型組(A)、彌可保組(B)、黃芪桂枝五物湯低(C)、中(D)、高劑量組(E)5組。5組動物的血糖水平在研究基礎上一致，差異無統計學意義(P＞0.05)。另取10只同批無差異大鼠作為正常對照組(F)。

1.4.2 給藥方法 模型復制1周后，加味黃芪桂枝五物湯低、中、高劑量組分別按4.5g/kg、9 g/kg、12.5g/kg劑量灌胃給藥，正常組和模型組灌服等容積的蒸餾水，彌可保組按375ug/kg灌胃，灌胃每日1次，連續8周給藥后取標本進行檢測。所需藥液用蒸餾水定期配制，4℃冰箱保存，大鼠實驗期間按組分籠飼養，標準飼料自由攝食、飲水。

1.4.3 檢測指標及方法

1.4.4 坐骨神經傳導速度檢測 第8周治療結束后，以戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉動物，在麻醉狀態下經十六導電生理儀檢測大鼠坐骨神經運動傳導速度(MNCV)［6］。用2個電極針經皮插入，第一刺激部位在坐骨窩，第二刺激部位在踝部，電極間距為2mm，接地于尾部，用方形波(10～20mA，40us脈波寬)刺激坐骨神經，用2個針電極在同側的足部骨間肌記錄復合肌肉動作電位。記錄3對不同的M波潛伏期取其平均值，近端和遠端的潛伏期差值作為運動神經在2個刺激部位間的傳導時間，再測量出2個刺激部位間的距離。根據公式計算MNCV(m/s)=距離/潛伏期差值，同樣方法檢測大鼠坐骨神經感覺傳導速度:(SNCV)=距離/潛伏期差值。

1.4.5 大鼠NGF表達 上述步驟完成后，大鼠在麻醉狀態下迅速剝離大腦海馬組織，置于4%的多聚甲醛固定液中固定。常規石蠟包埋、切片，以75%明膠處理過的載玻片接片，60℃烘片30min備用。所有步驟嚴格按照免疫組化試劑盒說明進行操作，圖片分析采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統進行圖像分析。每鼠取切片5張，400倍鏡下檢測各片的平均光密度值并計算 density值，分別測定后累加取其平均值，即為density值。終值單位為像素點，檢測場面積為15萬個像素點。

2 統計學方法

選用SPSS 17.0 for windows統計軟件進行統計分析，各項實驗數據以均數±標準差(±s)表示，各組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗。

3 結果

3.1 一般情況

實驗期間，正常組大鼠精神狀態良好，動作自如，毛色光澤。其余各組大鼠均出現多飲、多食、多尿、消瘦，皮毛污穢無光澤，精神萎靡，蜷臥拱背、后肢活動不靈活甚至痿廢不用等現象。實驗過程中模型組大鼠于第3周死亡2只，經解剖死于巨結腸，黃芪桂枝五物湯低劑量組1只于實驗第1周死于灌胃不當，其余組別大鼠未見死亡。

3.2 坐骨神經傳導速度

表1顯示，模型組大鼠坐骨神經傳導速度表達明顯低于其他各組，提示周圍神經病變明顯，各治療組與模型組比較差異均有統計學意義(P＜0.01或0.001)，提示藥物干預具有不同提高坐骨神經傳導速度作用，其強弱順序為F組＞E組＞D組＞C組＞B組。

表1 藥物干預8周后不同組別坐骨神經傳導速度

3.3 神經生長因子的表達

表2圖1顯示，模型組大鼠NGF表達明顯低于其他各組，各治療組與模型組比較差異均有統計學意義(P＜0.01或0.001)，提示藥物干預具有不同促進NGF表達的作用，其強弱順序為F組＞E組＞D組＞C組＞B組。

表2 藥物干預8周后不同組別神經生長因子的表達

圖1 光鏡下神經生長因子比較

4 討論

目前國內外廣泛認可的使用鏈脈佐菌素(STZ)制備糖尿病動物模型(血糖值大于16.65mmo1/L作為糖尿病大鼠空腹或非空腹的成模標準)［7］，因其同時具備了人類糖尿病性周圍神經病變的特點［8］，從而被廣泛地應用于DPN的實驗研究之中。坐骨神經傳導速度降低是糖尿病大鼠模型的周圍神經病變特點之一［9］。DPN時，神經功能的改變先于并伴隨神經解剖的損害，因而神經電生理檢查作為早期診斷DPN的敏感指標被大家認可;臨床上許多DPN患者在出現運動、感覺障礙之前就有明顯的神經傳導速度減慢［10］現象，神經傳導速度減慢被看做是糖尿病性神經病變發生的先兆之一，這也是該項檢測成為目前評價糖尿病患者神經功能最常用指標的原因;神經生長因子(NGF)是最先發現的細胞生長調節因子，NGF是交感神經元、感覺神經元和中樞部分膽堿能神經元生長、發育、存活、維持功能所必需的營養因子，其生物學活性主要是維持交感神經和感覺神經的功能，能誘導神經遞質的合成、蛋白磷酸化、甲基化以及類似ras蛋白的基因表達所需酶的合成，能有選擇地營養交感神經節神經元和周圍神經系統的小纖維感覺神經元。已有實驗證明，無論是糖尿病動物模型還是糖尿病神經病變患者，其組織或血中的NGF水平均明顯降低［11-12］。本次實驗觀察到，模型組大鼠坐骨神經傳導速度明顯降低，神經生長因子表達明顯下調，與正常對照組比較差異有極顯著統計學意義(P＜0.01)，提示模型組大鼠具備DPN的特點。

目前，西醫針對DPN缺乏理想的治療方法［13］，中醫學從整體出發，調理陰陽，對于該病復雜病理機制，中藥復方的作用呈現出多途徑、多靶點和多系統的特點，尤其是在改善患者癥狀、提高生活質量及遠期療效上顯示了獨特的優勢，是單靶點和單系統化學合成藥不可比擬的。因此，充分發揮中醫藥簡便效廉的特點，開發有效中藥復方，對解決DPN這一臨床難題是切實可行的。黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》:“血痹，陰陽俱微，寸口關上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風痹狀，黃芪桂枝五物湯主之。”方中黃芪為君藥，甘溫益氣固表;桂枝散風寒而溫經通痹;芍藥養血和營而通血痹，與桂枝合用，調和營衛而和表里，兩藥為臣;生姜辛溫，疏散風邪，以助桂枝之力;大棗甘溫，養血益氣以資黃芪、芍藥之功，兩藥為佐使，5味藥物配伍精當，共奏養血祛風、益氣通絡、調和營衛之功。臨床之中以身體外周痛、癢、麻木為該方的使用要點，這正與糖尿病周圍神經病變的常見表現相類似，都反映了營衛氣血不足、風寒閉阻經絡這一核心病機，因此針對這一核心病機的黃芪桂枝五物湯可作為臨床治療DPN的基本方。本次實驗觀察到，彌可保組較模型組大鼠神經傳導速度和NGF表達差異均有統計學意義(P＜0.05)，說明彌可保對實驗性糖尿病鼠周圍神經損害有一定的防治作用，這與以往文獻報道一致［13］。但我們同時觀察到，黃芪桂枝五物湯高、中、低劑量組亦有效提高糖尿病大鼠神經傳導速度，并上調NGF的表達，與模型組和彌可保組比較，差異皆有統計學意義(P＜0.05或0.01)，顯示黃芪桂枝五物湯對糖尿病大鼠周圍神經功能有明顯改善作用，其作用與劑量成正比，上調NGF的表達可能是其作用機制之一。

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