奧拉西坦注射液細菌內毒素檢測方法的研究

江蘇省泰州市食品藥品檢驗所（225300）姜愛芳

奧拉西坦為吡拉西坦的類似物，可促進磷酰膽堿和磷酰乙醇胺合成，提高大腦中ATP/ADP的比值，使大腦中蛋白質和核酸的合成增加。適用于腦損傷及其引起的神經功能缺失、記憶與智能障礙等癥的治療。國家藥品標準[1]中對其采用家兔熱原檢查法，鑒于鱟試劑用于細菌內毒素的檢測具有靈敏度高、操作簡便的特點，筆者參照《中國藥典》2010年版細菌內毒素檢查法[2]和相關文獻[3][4][5]，對奧拉西坦注射液進行了細菌內毒素的檢測試驗，現(xiàn)將結果總結分析如下。

1 實驗材料

鱟試劑（以下簡稱TAL）[批號：1206190，標示靈敏度（λ）0.25EU/mL，0.1mL/支，10支/盒（湛江博康海洋生物有限公司）；批號：1207141，標示靈敏度（λ）0.25EU/mL，0.1mL/支，10支/盒（湛江安度斯生物有限公司）]；細菌內毒素檢查用水（以下簡稱BET水）[批號：2010-1，10mL/支，10支/盒（中國藥品生物制品檢定所）]；細菌內毒素工作標準品（以下簡稱WSE）[批號：150601-201174，效價160EU/支，中國藥品生物制品檢定所]；奧拉西坦注射液注射液[批號：111017B、120522B，規(guī)格5mL∶1g，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司]。

附表1 鱟試劑靈敏度復核

附表2 奧拉西坦注射液的干擾試驗預試驗結果

附表3 奧拉西坦注射液注射液的干擾試驗結果

附表4 2個批號注奧拉西坦注射液細菌內毒素檢查結果

儀器設備：ET-96內毒素凝膠法測定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)大儀器廠）；微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司），吸管，毛細管等均經除熱原處理。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核 按照《中國藥典》2010年版二部附錄XIE“細菌內毒素檢查法”規(guī)定，進行鱟試劑的標示靈敏度復核，結果見附表1。

兩批鱟試劑經用細菌內毒素工作標準品檢查λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）之間，結果均符合規(guī)定。

2.2 細菌內毒素理論限值（L）的確定細菌內毒素計算公式：L＝K/M。本品為注射劑，K＝5EU?kg-1?h-1。M為6000/60＝100mg?kg-1?h-1（根據產品說明書：每日1次，每次4～6g）。限值L＝5/100＝0.05EU/mg。根據細菌內毒素檢查法建立的指導原則[6]，可將計算值適當調整，嚴格至計算限值的1/2或1/3，最終確定限值為0.02EU/mg。

2.3 干擾試驗預試驗 奧拉西坦注射液最小有效稀釋濃度（MVC）的計算公式：MVC＝λ/L，其中L為奧拉西坦注射液的細菌內毒素限值0.02EU/mg，λ為鱟試劑標示靈敏度。目前，市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03EU/mL。則奧拉西坦注射液的對應最小有效稀釋濃度為25mg/mL；12.5mg/mL；6.25mg/mL；3.12mg/mL；1.5m/mL。

將奧拉西坦注射液用BET水分別稀釋成濃度為100mg/mL；50mg/mL；25mg/mL；12.5mg/mL；6.25mg/mL；3.12mg/mL；1.5mg/mL的溶液，將此系列濃度溶液標記為NPC。同時，在上述試驗液中加入細菌內毒素標準溶液，使每一濃度的試驗溶液中均含有2λ濃度的細菌內毒素，記此系列溶液為PPC。取靈敏度為0.25EU/mL的兩個不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC和PPC進行反應。每一濃度設2管，同時設陰性（NC）和陽性（PC）對照管，混勻后封口，置37 ℃恒溫水浴60min，做干擾試驗的預實驗，結果見附表2。

從附表2結果可以看出，由以上干擾預試驗結果可以初步了解：兩個廠家鱟試劑對奧拉西坦注射液的細菌內毒素試驗結果在12.5mg/mL及以下濃度時均無干擾作用。

2.4 供試品干擾試驗[7]用BET水將2批奧拉西坦注射液配成12.5mg/mL的溶液，用該濃度溶液和BET水分別將WSE稀釋成含內毒素0.5、0.25、0.125、0.06EU/mL的溶液，然后步驟進行干擾試驗，結果見附表3。正式干擾試驗結果表明：Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2.0λ）時， 2個批號含12.5mg/mL供試品的Et值均在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）范圍之間，確認供試品在該濃度下無干擾作用。

2.5 供試品細菌內毒素檢查 將2批樣品分別用BET水稀釋成12.5mg/mL的溶液，用此濃度將細菌內毒素工作標準品稀釋為2.0λ濃度的溶液，作為供試品陽性對照，用λ為0.25EU/mL的鱟試劑進行細菌內毒素檢測，結果見附表4。

3 討論

3.1 從以上的實驗結果看出，12.5mg/mL的樣品稀釋液對標示靈敏度為0.25EU/mL的鱟試劑無干擾作用，用細菌內毒素檢查法替代奧拉西坦注射液熱原檢查是可行的。2批奧拉西坦注射液熱原檢查符合規(guī)定，與細菌內毒素檢查結果一致。

3.2 對供品進行干擾試驗預試驗，是評價藥品濃度對鱟試劑與內毒素凝聚反應的干擾程度及干擾性質，以便初步篩選出對檢查無干擾的樣品濃度范圍，同時也可節(jié)約鱟試劑、細菌內毒素標準品的用量，而且可以減少工作量。為確保實驗準確性，采用了2個廠家的鱟試劑進行測試，結果均滿意。

3.3 本文建立的奧拉西坦注射液細菌內毒素檢查標準方法可行。既為臨床安全用藥提供技術依據，又為完善藥品質量標準提供參考。